通过NRF2及其下游目标基因的表达状态和突变状态诊断和治疗癌症的方法与流程

文档序号:17930540发布日期:2019-06-15 00:48
通过NRF2及其下游目标基因的表达状态和突变状态诊断和治疗癌症的方法与流程

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技术领域

本发明总体上涉及用于诊断、治疗癌症(例如肺癌)和提供癌症(例如肺癌)预后的方法。

发明背景

癌症仍然是对人健康最致命的威胁之一。尽管最近在治疗方面取得了进展,但肺癌尤其在美国是男性和女性癌症相关死亡的主要原因。大多数肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC),并且最常见的是腺瘤或鳞状亚型。最近的研究已经确定了这些适应症背后的点突变模式 (Imielinski等Cell.150(6):1107-1120,2012),但尽管与各种细胞途径相关的已鉴定的突变的数量越来越多,缺乏对这些突变对这些细胞途径的性质和影响的全面理解。

因此,本领域存在未满足的需求,以开发用于癌症(诸如肺癌)的有效诊断和治疗策略。



技术实现要素:

本发明提供用于诊断、治疗(例如,肺癌(例如,非小细胞肺癌 (NSCLC))和头颈癌)和提供所述癌症的预后的组合物和方法。

在一个方面,本发明的特征在于诊断受试者中的癌症的方法,该方法包括:(a)测定获自所述受试者的样品中选自由以下组成的组的至少一种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9 种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18 种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种或27 种)基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、 GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL;(b)将所述至少一种基因的表达水平与所述至少一种基因的参照表达水平进行比较,其中样品中的所述至少一种基因的表达水平相对于所述至少一种基因的参照表达水平的升高鉴定患有癌症的受试者。

在另一个方面,本发明的特征在于鉴定患有为NRF2依赖性癌症的癌症的受试者的方法,该方法包括:(a)测定获自所述受试者的样品中选自由以下组成的组的至少一种(例如,1种、2种、3种、4种、5 种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、 15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、 24种、25种、26种或27种)基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、 SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、 SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、 NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、 NQO1和FTL;(b)将所述至少一种基因的表达水平与所述至少一种基因的参照表达水平进行比较;和(c)确定所述受试者的癌症是否是 NRF2依赖性癌症,其中所述样品中的所述至少一种基因的表达水平相对于所述至少一种基因的参照表达水平的升高鉴定患有NRF2依赖性癌症的受试者。在任一前述方面的一些实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少两种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、 14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、 23种、24种、25种、26种或27种))基因的表达水平:AKR1B10、 AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、 CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、 AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、 PGD、TXN、NQO1和FTL。在一些实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少三种(例如,3种、4种、5种、6 种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、 16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、 25种、26种或27种))基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、 OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、 TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、 UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1 和FTL。在一些实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少四种(例如,4种、5种、6种、7种、8种、9种、10 种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19 种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种或27种))基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL。在一些实施方案中,测定获自受试者的样品中的AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、 OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、 TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、 UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1 和FTL的表达水平。

在一些实施方案中,测定AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、 FECH、GCLM、TRIM16、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、 TXN或NQO1中的至少一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5 种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、 15种、16种、17种、18种、19种、20种和21种)的表达水平。在一些实施方案中,测定AKR1B10、AKR1C2、ME1、KYNU、CABYR、 TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、AKR1B15、NR0B1和AKR1C3 的一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8 种、9种、10种、11种或12种)的表达水平。

在一些实施方案中,(a)样品中至少两种基因的表达水平是样品的至少两种基因的平均值(例如,平均值或中值);(b)所述至少两个基因的参照照表达水平是所述参照的至少两个基因的平均值(例如,平均值或中值);以及(c)将样品的所述至少两个基因的平均值(例如,平均值或中值)与所述参照的至少两个基因的平均值进行比较。

在一些实施方案中,参照表达水平是受试者群体中所述至少一种基因的平均表达水平。在一些实施方案中,受试者群体是共享共同种族性的受试者群体。

在一些实施方案中,参照表达水平是患有癌症(例如,肺癌,例如,非小细胞肺癌(NSCLC),例如鳞状NSCLC)的受试者群体中的至少一种基因的平均表达水平。

在一些实施方案中,表达水平是mRNA表达水平。在一些实施方案中,通过PCR、RT-PCR、RNA测序、基因表达谱分析、基因表达系列分析或微阵列分析测定mRNA表达水平。

在一些实施方案中,表达水平是蛋白质表达水平。在一些实施方案中,蛋白质表达水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学或质谱法测定。

在一些实施方案中,任何前述方法还包括测定NRF2的DNA序列。在一些实施方案中,通过PCR、外显子组测序(exome-seq)、微阵列分析或全基因组测序确定DNA序列。

在另一个方面,本发明的特征在于诊断受试者中的癌症的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的DNA序列,其中包含其外显子2的全部或部分缺失的NRF2DNA的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,通过PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序确定DNA序列。

在另一个方面,本发明的特征在于鉴定患有癌症的受试者的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的NRF2的mRNA表达水平,所述NRF2包含其外显子2的全部或部分缺失,其中包含其外显子2的全部或部分缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,通过PCR、RT-PCR、RNA测序、基因表达谱分析、基因表达系列分析或微阵列分析测定mRNA表达水平。在一些实施方案中,所述方法还包括测定NRF2的DNA序列。在一些实施方案中,通过PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序确定DNA 序列。

在任何前述方面的一些实施方案中,NRF2还包含其外显子3的全部或部分的缺失。

在另一个方面,本发明的特征在于诊断受试者中的癌症的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的NRF2的蛋白质表达水平,所述NRF2包含其Neh2结构域的全部或部分缺失,其中包含其Neh2 结构域的的全部或部分缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。

在另一个方面,本发明的特征在于鉴定患有癌症的受试者的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的NRF2的蛋白质表达水平,所述NRF2包含其Neh2结构域的全部或部分缺失,其中包含其 Neh2结构域的全部或部分缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。

在任何前述方面的一些实施方案中,NRF2还包含其Neh4结构域的全部或部分的缺失。在一些实施方案中,蛋白质表达水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学或质谱法测定。

在一些实施方案中,所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的 NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的抗癌剂。在其它实施方案中,该方法包括施用抗癌剂和NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,共同施用抗癌剂和NRF2 途径拮抗剂。在一些实施方案中,相继地施用抗癌剂和NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,抗癌剂选自由以下组成的组:抗血管生成剂、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂和免疫疗法。在一些实施方案中,抗血管生成剂是VEGF拮抗剂。在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂选自由以下组成的组:CREB拮抗剂、CREB结合蛋白(CBP) 拮抗剂、Maf拮抗剂、激活转录因子4(ATF4)拮抗剂、蛋白激酶C(PKC) 拮抗剂、Jun拮抗剂、糖皮质激素受体拮抗剂、UbcM2拮抗剂、HACE1 拮抗剂、c-Myc激动剂、SUMO激动剂、KEAP1激动剂、CUL3激动剂或视黄酸受体α(RARα)激动剂。

在一个方面,本发明的特征在于治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:向所述受试者施用治疗有效量的NRF2途径拮抗剂,其中以下基因中的至少一种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、 7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、 17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、 26种或27种)在获自受试者的样品中的表达水平经测定相对于所述至少一种基因的参照表达水平得以升高:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、 OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、 TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、 UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1 和FTL。在其它实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少两种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8 种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种或 27种))基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、 GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL。在其它实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少三种 (例如,3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12 种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21 种、22种、23种、24种、25种、26种或27种))基因的表达水平: AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、 ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、 RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、 TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL。在其它实施方案中,测定获自受试者的样品中的选自由以下组成的组的至少三种(例如,4种、5 种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、 15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、 24种、25种、26种或27种))基因的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、 SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、 SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、 NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、 NQO1和FTL。在其它实施方案中,测定获自受试者的样品中的 AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、 ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、 RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、 TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL的表达水平。

在一些实施方案中,测定AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、 FECH、GCLM、TRIM16、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、 AKR1C4、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、 TXN或NQO1中的至少一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5 种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、 15种、16种、17种、18种、19种、20种和21种)的表达水平。在其它实施方案中,测定AKR1B10、AKR1C2、ME1、KYNU、CABYR、 TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、AKR1B15、NR0B1和AKR1C3 的一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8 种、9种、10种、11种或12种)的表达水平。

在一些实施方案中,(a)样品中至少两种基因的表达水平是所述样品的所述至少两种基因的平均值(例如,平均值或中值);(b)所述至少两个基因的参照表达水平是所述参照的所述至少两个基因的平均值 (例如,平均值或中值);以及(c)将样品的所述至少两个基因的平均值 (例如,平均值或中值)与所述参照的所述至少两个基因的平均值进行比较。在一些实施方案中,参照表达水平是受试者群体中所述至少一种基因的平均表达水平。在一些实施方案中,受试者群体是共享共同种族性的受试者群体。在一些实施方案中,参照表达水平是患有癌症的受试者群体中所述至少一种基因的平均表达水平。

在一些实施方案中,肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC),例如鳞状 NSCLC。

在一些实施方案中,表达水平是mRNA表达水平。在一些实施方案中,通过PCR、RT-PCR、RNA测序、基因表达谱分析、基因表达系列分析或微阵列分析测定mRNA表达水平。在一些实施方案中, mRNA表达水平通过RNA测序来测定。

在一些实施方案中,方法还包括测定NRF2的DNA序列(通过 PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序)。

在一些实施方案中,表达水平蛋是白质表达水平。在一些实施方案中,蛋白质表达水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学或质谱法测定。

在另一个方面,本发明的特征在于治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:(a)测定获自受试者的样品中的NRF2的mRNA表达水平,所述NRF2包含其外显子2的全部或部分缺失,其中包含其外显子2的全部或部分缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症;和(b)向受试者施用治疗有效量的NRF2途径拮抗剂。

在一些实施方案中,通过PCR、RT-PCR、RNA测序、基因表达谱分析、基因表达系列分析或微阵列分析测定mRNA表达水平。在一些实施方案中,mRNA表达通过RNA测序来测定。在一些实施方案中,方法还包括测定NRF2的DNA序列(通过PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序)。

在另一个方面,本发明的特征在于治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:(a)测定获自受试者的样品中的NRF2的DNA序列,所述NRF2包含其外显子2的全部或部分缺失,其中包含其外显子2 的全部或部分缺失的NRF2DNA的存在将受试者鉴定为患有癌症;和(b)向受试者施用治疗有效量的NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,通过PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序确定DNA 序列。在一些实施方案中,NRF2(例如,mRNA或DNA)还包含其外显子3的全部或部分的缺失。

在另一个方面,本发明的特征在于治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:(a)测定获自受试者的样品中的NRF2的蛋白质表达水平,所述NRF2包含其Neh2的全部或部分缺失,其中包含其Neh2 的全部或部分缺失的NRF2蛋白的存在将受试者鉴定为患有癌症;和 (b)向受试者施用治疗有效量的NRF2途径拮抗剂。

在一些实施方案中,NRF2蛋白还包含其Neh4结构域的全部或部分的缺失。在一些实施方案中,蛋白质表达水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学或质谱法测定。在一些实施方案中,方法还包括测定 NRF2的DNA序列(通过PCR、外显子组测序、微阵列分析或全基因组测序)。

在一些实施方案中,方法包括向受试者施用治疗有效量的抗癌剂。在一些实施方案中,共同施用抗癌剂和NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,相继地施用抗癌剂和NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,抗癌剂选自由以下组成的组:抗血管生成剂、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂和免疫疗法。在一些实施方案中,抗血管生成剂是VEGF拮抗剂。在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂选自由以下组成的组:CREB拮抗剂、CREB结合蛋白(CBP)拮抗剂、Maf拮抗剂、激活转录因子4(ATF4)拮抗剂、蛋白激酶C(PKC)拮抗剂、Jun 拮抗剂、糖皮质激素受体拮抗剂、UbcM2拮抗剂、HACE1拮抗剂、 c-Myc激动剂、SUMO激动剂、KEAP1激动剂、CUL3激动剂或视黄酸受体α(RARα)激动剂。

在一些实施方案中,获自受试者的样品是肿瘤样品,例如来自活检样品。在一些实施方案中,样品获自先前未治疗的受试者。在一些实施方案中,受试者患有肺癌(例如,非小细胞肺癌(NSCLC),例如鳞状NSCLC)或头颈癌(例如,鳞状头颈癌)。

附图说明

图1A是显示经历RNA测序、外显子组测序和SNP阵列分析的 96个肺癌细胞系的图。显示了KRAS、TP53、KEAP1、EGFR、STK11、 NFE2L2和NF1的改变。

图1B是显示NFE2L2(NRF2)基因中的点突变的蛋白质序列表示。

图1C是显示KEAP1基因中的点突变的蛋白质序列表示。

图1D是KEAP1/NRF2肽复合物的晶体结构的图像。

图2A是说明突变型(n=25)对比野生型(WT)(n=74)KEAP1 NSCLC细胞系中所有基因的平均表达水平的比率以及由差异表达分析产生的相关调整的p值的火山图。指示了显著差异表达的基因(>2 倍,p<0.01),并且先前鉴定为NRF2靶标的基因组被鉴定为黑点。

图2B是显示无监督沃德聚类(unsupervised ward clustering)结果的热图,所述无监督病房聚类结果显示了在NSCLC细胞系中与 KEAP1突变相关的27种基因的上调。

图3A是显示无监督沃德聚类结果的热图,所述无监督病房聚类结果显示了NSCLC细胞系衍生的KEAP1基因标签将来自癌症基因组图谱(TCGA)的40种KEAP1突变型肺腺癌中的32种(80%)进行分类。

图3B是显示无监督病房聚类结果的热图,所述无监督沃德聚类结果显示了NSCLC细胞系衍生的KEAP1基因标签将来自TCGA的 22种KEAP1突变型肺鳞状细胞癌中的19种(86%)和27种NRF2突变型肺鳞状细胞癌中的27种(100%)进行分类。

图4是显示突变型(n=6)和WT(n=37)NSCLC细胞系中KEAP1 基因标签的蛋白质产物的相对丰度的图。

图5是表示在19种肿瘤适应症中看到的复发性剪接改变的频率的热图。

图6显示了从RNA测序数据预测的NRF2外显子和剪接点。与两个带注释的refGene转录本一致的预测特征以灰色显示。对应于外显子2(J2,J5)或外显子2+3(J3,J6)的跳跃的经鉴定的外显子-外显子接合点分别以黑色和灰色显示。热图显示log2(x+1)转换后FPKM 量表上482个TCGA肺鳞状细胞癌(行)中的外显子-外显子接合点(列) 的读段证据。

图7是描绘EGFR、NRF2、MET和CTNNB1中的剪接改变对蛋白质结构的影响的示意图。箭头表示作为剪接改变的结果的框内缺失。

图8A是说明鳞状NSCLC中KEAP1或NRF2中的NRF2剪接改变和突变的相互排斥发生的维恩图。

图8B是显示基于27个候选NRF2靶基因的鳞状NSCLC的聚类的热图。针对每个样品指示突变状态和NRF2剪接改变。

图9A是说明头颈癌中KEAP1或NRF2中的NRF2剪接改变和突变的相互排斥发生的维恩图。

图9B是显示基于27个候选NRF2靶基因的头颈癌的聚类的热图。针对每个样品指示突变状态和NRF2剪接改变。

图10是显示通过RNA测序定量的在KMS-27和JHH-6细胞中跳过外显子2的接合读段(junction read)的存在的图。

图11A是显示WT和外显子2缺失的NRF2(Δe2NRF2)mRNA 中的外显子的位置的示意图,所述位置与源自外显子1和外显子3/4 的正向和反向引物(分别由右侧朝向和左侧朝向的箭头指示的)相关。

图11B是一系列琼脂糖凝胶图像,其显示通过RT-PCR从正常白细胞、JHH-6细胞和KMS-27细胞的总RNA扩增的RNA产物。用指定的引物扩增NRF2外显子2周围的区域。显示来自野生型NRF2、Δe2NRF2和引物二聚体的片段。表明存在Δe2NRF2RNA的条带在 JHH-6和KMS-27细胞中是可见的。

图12A是显示来自JHH-6和KMS-27细胞的PCR产物的测序结果的图,指示了NRF2中外显子2的缺失。

图12B显示Δe2NRF2的核酸和氨基酸序列。

图12C显示野生型NRF2的核酸和氨基酸序列。外显子2序列加阴影。

图13显示蛋白质印迹实验的结果,其显示HUH-1、JHH-6和HuCCT1细胞的磷酸化NRF2、野生型NRF2和Δe2NRF2的相对表达。通过SDS PAGE分离来自指定细胞系的蛋白质裂解物。*代表可能的非特异性条带,因为其不被NRF2 siRNA转染耗尽。

图14A显示蛋白质印迹实验的结果,其显示在λ磷酸酶(λP’tase) 存在和不存在的情况下HUH-1、JHH-6和HuCCT1细胞的磷酸化 NRF2、野生型NRF2和Δe2NRF2的相对表达。使细胞在6孔培养皿中生长,并用100μg/ml环己酰胺(CHX)处理指定的时间。将裂解物与缓冲液或400单位λ磷酸酶一起孵育30分钟,然后通过SDS PAGE 分离并用NRF2抗体进行蛋白质印迹。

图14B是显示在CHX存在的情况下由HuCCT1细胞(圆圈)、 JHH-6细胞(正方形)和HUH1细胞(三角形)表达的NRF2蛋白质的稳定性的图。对来自图14A中所示结果的条带强度进行定量并与单相衰减曲线拟合以获得蛋白质半衰期估计,其示于每条曲线旁边。将相对蛋白质表达作为每种细胞系的初始浓度的百分比。

图14C显示蛋白质印迹实验的结果,其显示在用siNTC(50nM) 或siKEAP1(50nM)处理后HUH-1、JHH-6和HuCCT1细胞的NRF2 和Δe2NRF2的相对表达。使细胞在6孔培养皿中生长,并用100μg/ml 环己酰胺(CHX)处理指定的时间。将裂解物与400单位λ磷酸酶一起孵育30分钟,然后通过SDS PAGE分离并用NRF2抗体进行蛋白质印迹。

图14D是显示在用siNTC(实线)或siKEAP1(虚线)转染后在 CHX存在的情况下由HuCCT1细胞(圆圈)、JHH-6细胞(正方形)和 HUH1细胞(三角形)表达的NRF2蛋白质的稳定性的图。对来自图14C 中所示结果的条带强度进行定量并将其拟合至单相衰减曲线以获得蛋白质半衰期估计,其示于每条曲线旁边。将相对蛋白质表达作为每种细胞系的初始浓度的百分比。

图15显示蛋白质印迹实验的结果,其表明KMS-27细胞表达Δe2 NRF2。制备来自HCC-1354、KMS-27和HuCCT1细胞的20μg裂解物,并且除HuCCT1外用λP'tase处理所有细胞。然后将未处理和处理的裂解物进行SDS PAGE,并检测NRF2和肌动蛋白。

图16显示蛋白质印迹实验的结果,其显示NRF2的核定位。将 HuCCT1、HUH-1和JHH-6细胞在10cm培养皿中培养,并分成核和细胞溶质级分。通过SDS PAGE分离级分,并观察NRF2。使用Hsp90 作为细胞溶质标志物以及HDAC2作为核标志物来估计核和细胞溶质纯度。

图17A是显示在16个肝细胞癌细胞系(由黑色方块、实心灰色圆圈和空心灰色圆圈表示)中KEAP1基因标记的27个标签NRF2靶基因(各自显示在x轴上)的表达的图,该图使用在Klijn等(Nat Biotechnol. 33(3):306-312,2014)中描述的RNA测序数据。。实心灰色圆圈代表突变型KEAP1肝癌细胞系,而空心灰色圆圈代表JHH-6细胞系。

图17B是显示在18个多发性骨髓瘤细胞系(由黑色方块和空心灰色圆圈表示)中KEAP1基因标签的27个标签NRF2靶基因(各自显示在x轴上)的表达的图,该图使用在Klijn等(Nat Biotechnol.33(3): 306-312,2014)中描述的RNA测序数据。。空心灰色圆圈代表KMS-27 细胞系。

图18A是显示16个肝细胞癌细胞系中NRF2靶基因评分(在整个数据集上测定的27个NRF2靶基因的平均z-评分)的条形图。KEAP1 和NRF2改变分别表示为实心和轮廓框。

图18B是显示18个多发性骨髓瘤细胞系中NRF2靶基因评分(在整个数据集上测定的27个NRF2靶基因的平均z-评分)的条形图。概述框表示NRF2改变。

图19是显示在存在或不存在靶向NRF2的siRNA的情况下 HUH-1、JHH-6和HuCCT1细胞的活力的条形图。将细胞接种到96 孔板中,所述96孔板含有非靶向siRNA对照(NTC)或靶向NRF2的 siRNA(NRF2)。4天后使用CellTiter-Glo测量活力。活力表示为NTC 发光的百分比。

图20是显示转染试剂对HUH-1、JHH-6和HuCCT1细胞的相对 NRF2表达的影响的一系列条形图。使细胞在6孔培养皿中生长,并用靶向NRF2的NRF2外显子5的siRNA进行转染。48小时后分离总RNA,并使用靶向外显子5的Taqman探针测量NRF2表达。

图21是一系列条形图,其显示转染试剂对由HUH-1细胞(深灰色阴影条)、JHH-6细胞(江灰色阴影条)和HuCCT1细胞(黑色阴影条) 表达的四种充分表征的NRF2靶基因SLC7A11、GCLC、NR0B1和 SGRN的影响。使细胞在6孔培养皿中生长,并用靶向NRF2的NRF2 外显子5的siRNA或非靶向siRNA(NTC)进行转染。48小时后分离总RNA,并使用靶向指定的NRF2靶基因的Taqman探针测量基因表达。

图22是显示NRF2靶向siRNA对HUH-1、JHH-6和HuCCT1 细胞中DNA片段的影响的一系列代表性FACS柱状图。用星形孢菌素处理细胞作为阳性对照。

图23是显示NRF2外显子2和外显子2+3缺失对KEAP1相互作用的影响的一系列免疫印迹。用表达FLAG-NRF2、Δe2FLAG-NRF2、Δe2+3FLAG-NRF2或HA-KEAP1的质粒转染293细胞。转染后48 小时,裂解细胞,并使用所示抗体通过蛋白质印迹分析裂解物(顶部凝胶)或抗FLAG免疫沉淀物。

图24A是列显示环己酰胺对NRF2稳定性的影响的一系免疫印迹。用与图23中所述的相同的质粒转染293种细胞,并用100μg/ml 环己酰亚胺(CHX)处理指定的时间。裂解细胞并通过SDS PAGE分离,并使用NRF2和抗肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹。

图24B是显示KEAP1表达后随时间推移的截短的NRF2的稳定性的图。

图25是显示各种NRF2靶基因在各种条件下的表达的一系列条形图。如图24A-24B所述处理细胞,但收获总RNA,将所述总RNA 用于使用Taqman RT-PCR分析所示基因的表达。

图26是显示根据KEAP1和NRF2的突变状态绘制的TCGA鳞状NSCLC肿瘤中指示的NRF2靶基因的mRNA表达水平的一系列图。仅考虑了对于其可获外显子组测序和RNA测序数据的样品。排除一个在NRF2和KEAP1中都具有突变的样品。另外,具有NRF2 拷贝数变化│log2(CAN)│>0.5的证据的样品被排除在外。

图27A是外显子组测序图,其显示了808个癌细胞系中的相对 NRF2外显子丰度,显示了作图至外显子2的读段减少。

图27B是显示了1,218个鳞状NSCLC肿瘤中外显子读段覆盖的归一化z评分的外显子组测序图。将显示外显子2或外显子2+3的读段计数减少的11个肿瘤与附近的对照区域进行比较。

图28A是显示支持影响NRF2外显子2或外显子2+3的基因组改变的七个肿瘤中的不一致的读段对的基因组位置的示意图。

图28B是显示染色体2的拷贝数分析的一系列图,其显示具有 NRF2外显子2(左图)和外显子2+3(右图)局部缺失(focal deletion)的四个肿瘤样品。箭头指向NRF2外显子2和/或外显子3。靶区域的对数比以黑色显示,对照区域以灰色显示。

图28C是一系列全基因组测序图,其显示在JHH-6细胞、KMS-27 细胞以及原发性肿瘤中在NRF2外显子2周围以及邻近匹配的DNA 中存在微缺失。跨越缺失的读段的序列显示为NRF2NRF2。

图29是一系列琼脂糖凝胶图像,其显示从具有磷状NSCLC的选定患者的总RNA扩增的RNA产物。显示通过RT-PCR获得的自患者#58肿瘤组织、患者#64肿瘤组织、患者#63正常组织和患者 #63肿瘤组织的扩增产物。用图11A中指定的引物扩增NRF2外显子2周围的区域。显示来自野生型NRF2和Δe2NRF2的片段。RT-PCR 分析将患者#63鉴定为具有NRF2外显子2的丢失,其与邻近的正常组织相比在肿瘤中强烈富集。

图30是显示通过RNA测序定量的跳过外显子2的接合读段在肿瘤和正常细胞中的存在的图。

图31是来自肺鳞状细胞癌(LUSC)的TCGA样品的突变型KEAP1 基因标签评分的直方图。深灰色直方图代表KEAP1/NRF2突变型肿瘤,浅灰色直方图代表外显子2/3缺失的肿瘤,中灰色直方图代表 KEAP1/NRF2野生型肿瘤。通过计算基因标签中所有基因的基因表达 z评分的总和来测定给定样品的基因标签评分。

图32是来自肺鳞状细胞癌(LUSC)、肺腺瘤(LUAD)和头颈鳞状细胞癌(HNSC)的TCGA样品的突变型KEAP1基因标签评分的一系列直方图。深灰色直方图代表KEAP1/NRF2突变型肿瘤,浅灰色直方图代表外显子2/3缺失的肿瘤,中灰色直方图代表KEAP1/NRF2野生型肿瘤。通过计算基因标签中所有基因的基因表达z评分的总和来测定给定样品的基因标签评分。

图33是来自肺鳞状细胞癌(LUSC)、肺腺瘤(LUAD)和头颈鳞状细胞癌(HNSC)的TCGA样品的突变型KEAP1基因标签评分的一系列直方图。深灰色直方图代表肿瘤样品,浅灰色直方图代表正常样品。通过计算基因标签中所有基因的基因表达z评分的总和来测定给定样品的基因标签评分。

图34是显示通过WGS鉴定的JHH-6细胞、KMS-26细胞和原发性肿瘤中的缺失的结构的一系列连接读段序列。JHH-6细胞的3'末端、 5'末端和连接读段的DNA序列分别由SEQ ID NO:61-63提供。KMS-27细胞的3'末端、5'末端和连接读段的DNA序列分别由SEQ ID NO:64-66提供。原代肿瘤细胞的3'末端、5'末端和连接读段的DNA 序列分别由SEQ ID NO:67-69提供。

图35是显示NRF2的相对表达的一系列蛋白质印迹。用表达独立的非靶对照(NTC)或三个独立的NRF2 shRNA序列(sh1、sh2和sh3) 的慢病毒感染指定的细胞系,并在嘌呤霉素选择后用(+)或不用(-)500 ng/mL多西环素(dox)孵育48小时。

图36是显示在用或不用dox孵育7天后图35中所示细胞系的活力的图。使用CellTiter-Glo(CTG)ATP检测来测量活力。每个圆圈是六个技术重复的平均值,并且将其针对三个独立的NTC+dox的平均百分比活力进行归一化。

图37是显示用dox对比没有dox处理的细胞系的存活力的图。使细胞生长4天,并使用CTG ATP测量法测量活力。使用学生氏t 检验计算显著性。

图38是显示用NRF2 siRNA处理后相对于NTC处理后的28种 NSCLC细胞系的活力的图。将细胞按KEAP1基因型分组。使用学生氏t检验计算显著性。

图39是蛋白质印迹实验,其显示了NRF2在KEAP1突变型肿瘤中的表达。给小鼠植入表达NRF2 sh10的A549细胞。当肿瘤达到~200 mm3时,向饮用水中加入1mg/ml多西环素或5%蔗糖。五天后,将肿瘤提取物印迹以用于NRF2。

图40是显示NRF2在KEAP1突变型肿瘤中的表达的蛋白质印迹实验。给小鼠植入表达NRF2 sh10的H441细胞。当肿瘤达到~200mm 3时,向饮用水中加入1mg/ml多西环素或5%蔗糖。五天后,将肿瘤提取物印迹以用于NRF2。

图41A是显示植入KEAP1突变型肿瘤的小鼠中肿瘤体积的动力学的图。给小鼠植入表达NRF2 sh10的A549细胞系。当肿瘤达到~200 mm3时,将小鼠随机化至组(每组10只)中,并向饮用水中加入1mg/ml 多西环素或5%蔗糖。在28天的时期内测量肿瘤。误差棒代表SEM (n=10)。

图41B是显示植入KEAP1突变型肿瘤的小鼠中肿瘤体积的动力学的图。给小鼠植入表达NRF2 sh10的H441细胞系。当肿瘤达到~200 mm3时,将小鼠随机化至组(每组10只)中,并向饮用水中加入1mg/ml 多西环素或5%蔗糖。在28天的时期内测量肿瘤。误差棒代表SEM (n=10)。

图42是显示A549或H441细胞在各种生长条件下的表达的存活力的一系列条形图。将表达NTC或NRF2 sh10 shRNA的A549和H460 细胞接种到2D组织培养物处理的塑料皿或超低附着(ULA)包被的组织培养板中。然后将它们在环境氧浓度或0.5%氧气(缺氧)中培养5天。通过CTG ATP测量评估细胞活力。

图43是一系列照片,其显示用媒介物500ng/ml dox或1mM还原型谷胱甘肽(GSH)处理的软琼脂中KEAP1突变型细胞系(A549、 H1437和H460)和KEAP1野生型细胞系(H1048、H441和Calu6)的集落形成。拍摄了该板的代表性区域。

图44是显示图43中所示的每种细胞类型和处理组的定量集落形成的一系列条形图。误差棒表示生物一式三份孔的标准偏差。

图45是显示在微图案化纳米培养皿上形成A549菌落的一系列照片。在500ng/ml dox存在或不存在的情况下培养约5天后拍摄细胞。

图46是显示来自图45的细胞活力(通过CTG ATP测量法定量的) 的条形图。每个处理组的左栏代表1,000个细胞培养物,右栏代表 5,000个细胞培养物。

图47是显示在含甲基纤维素的组织培养皿中铺板的5,000个、 50,000个或500,000个NTC或NRF2sh10 shRNA表达A549细胞的一系列照片。在500ng/ml dox存在或不存在的情况下培养约10天后拍摄细胞。

图48是显示在常规组织培养皿(顶部)或软琼脂(底部)中铺板的表达NRF2sh10 shRNA的A549细胞的一系列照片。在2mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)存在或不存在的情况下,用媒介物或500ng/ml多西环素处理细胞。通过CTG ATP测量在约5天后测量2D生长的活力,并且在生长约10天后拍摄软琼脂中的细胞照片。

图49是显示在使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCF)测量的指定条件下的活性氧种类(ROS)水平的条形图。误差棒表示来自一式三份孔的标准偏差。

图50是显示NRF2敲低对SLC7A11的表达的影响的蛋白质印迹实验。将表达NRF2 sh10的A549细胞用媒介物或500ng/ml dox处理指定的时间点,并使用SLC7A11和β-肌动蛋白抗体进行印迹。

图51是显示在各种浓度的埃拉斯汀(erastin)下表达NTC1或 NRF2 sh10的A549细胞摄取胱氨酸的条形图。将表达NTC1或NRF2 sh10的A549细胞与载体或dox孵育48小时,然后与0.5uCi14C-胱氨酸孵育20分钟。裂解细胞并通过液体闪烁计数测量细胞内胱氨酸。

图52是显示响应于NRF2敲低的A549和H1437细胞中的谷胱甘肽(GSH)水平的条形图。

图53是显示如通过H2DCF测量的响应于shNRF2和/或埃拉斯汀的ROS水平升高的直方图。

图54是显示如使用CTG ATP测量法测量的约4天后在表达 shNTC或shNFR2的A549细胞相对于埃拉斯汀的剂量响应的活力的图。

图55A是显示如从图54中显示的剂量反应图推断的埃拉斯汀对 KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系的IC50的图。

图55B是显示作为图54中显示的剂量反应图的曲线下面积的 KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系的活力的图。

图56A是显示谷氨酰胺酶抑制剂BPTES对KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系的IC50的图。

图56B是显示KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系响应于谷氨酰胺酶抑制剂BPTES的活力的图。

图57A是显示谷氨酰胺酶抑制剂丁硫氨酸亚砜亚胺(buthionine sylphoximine)(BSO)对KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系的IC50的图。

图57B是显示KEAP1野生型细胞系对比KEAP1突变型细胞系响应于BSO的活力的图。

图58是显示在3D甲基纤维素培养皿相对于2D塑料组织培养皿中生长15天的KEAP1突变型NSCLC细胞中每个指定基因的平均 gRNA表达的散点图。用表达包含481个NRF2/KEAP1靶基因和37 个对照基因的gRNA文库的慢病毒(在1000x覆盖度下0.3MOI)感染 A549细胞。然后将嘌呤霉素抗性细胞接种到2D塑料组织培养皿中或在甲基纤维素中生长。在不同时间点之后,收集细胞并通过下一代测序鉴定gRNA。

图59是显示植入裸小鼠(xeno)中的对比在2D塑料组织培养皿中生长15天的KEAP1突变型NSCLC细胞中每个指定基因的平均 gRNA表达的散点图。用表达包含481个NRF2/KEAP1靶基因和37 个对照基因的gRNA文库的慢病毒(在1000x覆盖下0.3MOI)感染 A549细胞。然后将嘌呤霉素抗性细胞铺板到2D塑料组织培养皿中或植入裸小鼠中。在不同时间点之后,收集细胞并通过下一代测序鉴定gRNA。

图60是显示植入裸小鼠(xeno)的对比在3D甲基纤维素培养物中生长15天的KEAP1突变型NSCLC细胞中每个指定基因的平均 gRNA表达的散点图。用表达包含481个NRF2/KEAP1靶基因和37 个对照基因的gRNA文库的慢病毒(在1000x覆盖下0.3MOI)感染 A549细胞。然后将嘌呤霉素抗性细胞在甲基纤维素中生长或植入到裸小鼠中。在不同时间点之后,收集细胞并通过下一代测序鉴定 gRNA。

图61是显示响应于利用Erb2抗体YW57.88.5的处理的A549异种移植肿瘤体积的动力学的图。

图62是一系列照片,其显示在IGF1R抑制剂林西替尼和 NVP-AEW541存在的情况以及在谷胱甘肽存在或不存在的情况下,在软琼脂(非贴壁依赖性条件)中生长的KEAP1突变型细胞系和 KEAP1野生型细胞系的集落形成。

具体实施方式

I.引言

本发明提供癌症诸如肺癌(例如,NSCLC)或头颈鳞状癌(例如, HNSC)的诊断和伴随治疗方法。本发明至少部分基于以下发现:NRF2 中去除外显子2或外显子2+3的剪接变体导致在癌症中赋予NRF2激活的意外机制。NRF2剪接变体通过KEAP1或NRF2中的突变的互斥机制导致NRF2激活,但产生相似的NRF2靶基因表达谱。在具有导致这些NRF2剪接变体的微缺失的细胞系中,存在NRF2-KEAP1 相互作用的丧失,增加的NRF2稳定化,NRF2转录反应的诱导和 NRF2途径依赖性。这发生在3-6%的鳞状NSCLC和1-2%的HNSC 中,并且导致NRF2靶基因的类似激活和作为KEAP1突变的对途径的依赖性。

该发现可用于诊断患有癌症的受试者(例如,通过检测NRF2剪接变体或通过检测与NRF2剪接变体的存在一致的基因或蛋白质表达谱)和用于根据此类诊断治疗受试者(例如,通过施用治疗有效量的 NRF2途径拮抗剂,例如cAMP应答元件结合蛋白(CREB)结合蛋白 (CBP)抑制剂)。

II.定义

术语“诊断(diagnose)”、“诊断(diagnosing)”或“诊断(diagnosis)”在本文中用于指分子或病理状态、疾病或病症(例如,癌症)的鉴定或分类。例如,“诊断”可以是指特定类型的癌症的鉴别。“诊断”还可以是指例如通过组织病理学标准或通过分子特征(例如,特征在于生物标志物(例如,特定基因或由所述基因编码的蛋白质)中的一种或组合的表达的亚型)进行的癌症的特定亚型的分类。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理学病状,其特征通常在于细胞生长不受调控。该定义包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移(micrometastatses)。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症可包括例如乳腺癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌(例如、鳞状NSCLC))、各种类型的头颈癌(例如、HNSC)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌和肝癌、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性 NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病NHL(bulky disease NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病和移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏综合征相关的异常血管增殖。

本文中的“患者”或“受试者”是指有资格接受治疗,正在经历或经历过疾病或病症诸如癌症的一种或多种体征、症状或其它指标的任何单个动物(包括例如哺乳动物,诸如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、羊、非人灵长类动物和人),诸如人。作为患者而被包括的是参与临床研究试验但未显示任何疾病临床体征的任何患者,参与流行病学研究的患者或曾用作对照的患者。患者可能先前已经用NRF2 途径拮抗剂或另一种药物治疗,或者未经如此治疗。当开始本文的治疗时,患者可能初次接触使用的一种或多种另外的药物,即,患者可能先前在“基线”(即,在本文的治疗方法中施用第一剂量的NRF2途径拮抗剂之前的设定时间点,诸如在治疗开始前筛选受试者的当天)时未使用例如除NRF2途径拮抗剂(例如,VEGF拮抗剂或PD-1轴结合拮抗剂)外的疗法进行治疗。这种“首次接触药物真的”患者或受试者通常被认为是用一种或多种此类另外的药物治疗的候选者。

术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用,并且通常是指生物样品中生物标志物的量。“表达”通常是指籍以将信息(例如,基因编码的信息和/或表观遗传信息)转换成在细胞中存在和操作的结构的过程。因此,如本文中所用,“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成多肽,或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如,多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽的片段或多核苷酸和/或多肽修饰(例如,多肽的翻译后修饰),无论它们源自通过可变剪接产生的转录物或降解的转录物还是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解),也应被视为表达的。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(作为mRNA)然后翻译成多肽的那些基因,以及转录成RNA但不翻译成多肽的那些基因 (例如,转运RNA和核糖体RNA)。

术语“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用,是指DNA、 RNA、蛋白质、碳水化合物或基于糖脂的分子标志物,可通过标准方法(或本文公开的方法)检测其在受试者或患者样品中的表达或存在。此类生物标志物包括但不限于表1中列出的mRNA序列及其编码的蛋白质。可以确定此类生物标志物的表达在获自对NRF2途径拮抗剂敏感或作出响应的患者的样品中比参照水平(包括例如,来自患者(例如,患有癌症并将测试其对NRF2途径拮抗剂的响应性的患者)的组/ 群体的样品中生物标志物的平均(例如,平均值或中位值)表达水平;来自患者(例如,患有癌症并且被鉴定为不响应于NRF2途径拮抗剂的患者)的组/群体的样品中生物标志物的中位表达水平;先前获自个体的样品中的水平;或者来自在原发性肿瘤的情况下接受了利用 NRF2途径拮抗剂的先前治疗并且现在可能正在经历转移的患者的样品中的水平)高或低。具有大于或小于至少一种基因(诸如表1中列出的那些基因)的参照表达水平的表达水平的个体,可被鉴定为可能对利用NRF2途径拮抗剂的治疗起反应的受试者/患者。例如,表现出相对于(即,高于或低于)参照水平(诸如平均水平)最极端50%、45%、 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的基因表达水平的受试者/患者可被鉴定为可能响应于NRF2途径拮抗剂治疗的受试者/ 患者(例如,患有癌症的患者)。

表1.

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“ABCC2”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然ABCC2(ATP结合盒亚家族C,成员2)。该术语包括“全长”,未加工的ABCC2以及由细胞中的加工产生的 ABCC2的任何形式。该术语还包括天然存在的ABCC2变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人ABCC2的核酸序列示于SEQ ID NO:1中。由人ABCC2编码的示例性蛋白质的氨基酸序列显于SEQ ID NO:33中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“AKR1B10”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然AKR1B10(醛-酮还原酶家族1,成员 B10)。该术语包括“全长”、未加工的AKR1B10以及由细胞中的加工产生的AKR1B10的任何形式。该术语还包括天然存在的AKR1B10 变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人AKR1B10的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2中。由人AKR1B10编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:34中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“AKR1B15”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然AKR1B15(醛-酮还原酶家族1,成员 B15)。该术语包括“全长”、未加工的AKR1B15以及由细胞中的加工产生的AKR1B15的任何形式。该术语还包括天然存在的AKR1B15 变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人AKR1B15的核苷酸序列示于SEQ ID NO:3中。由人AKR1B15编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:35中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“AKR1C2”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然AKR1C2(醛-酮还原酶家族1,成员 C2)。该术语包括“全长”、未加工的AKR1C2以及由细胞中的加工产生的AKR1C2的任何形式。该术语还包括天然存在的AKR1C2变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人AKR1C2的核苷酸序列示于SEQ ID NO:4中。由人AKR1C2编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:36中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“AKR1C3”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然AKR1C3(醛-酮还原酶家族1,成员 C3)。该术语包括“全长”、未加工的AKR1C3以及由细胞中的加工产生的AKR1C3的任何形式。该术语还包括天然存在的AKR1C3变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人AKR1C3的核苷酸序列示于SEQ ID NO:5中。由人AKR1C3编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:37中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“AKR1C4”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然AKR1C4(醛-酮还原酶家族1,成员 C4)。该术语包括“全长”、未加工的AKR1C4以及由细胞中的加工产生的AKR1C4的任何形式。该术语还包括天然存在的AKR1C4变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人AKR1C4的核苷酸序列示于SEQ ID NO:6中。由人AKR1C4编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:38中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“CABYR”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然CABYR(钙结合酪氨酸-(Y)-磷酸化调节的)。该术语包括“全长”、未加工的CABYR以及由细胞中的加工产生的CABYR的任何形式。该术语还包括天然存在的CABYR变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人CABYR的核苷酸序列示于 SEQ ID NO:7中。由人CABYR编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:39中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“CYP4F11”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然CYP4F11(细胞色素P450,家族4,亚家族F,多肽11)。该术语包括“全长”、未加工的CYP4F11以及由细胞中的加工产生的CYP4F11的任何形式。该术语还包括天然存在的CYP4F11变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人CYP4F11 的核苷酸序列示于SEQ ID NO:8中。由人CYP4F11编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:40中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“FECH”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然FECH(亚铁螯合酶)。该术语包括“全长”、未加工的FECH以及由细胞中的加工产生的FECH的任何形式。该术语还包括天然存在的FECH变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人FECH的核苷酸序列示于SEQ ID NO:9中。由人FECH编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:41中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“FTL”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然FTL(铁蛋白,轻多肽(Light Polypeptide))。该术语包括“全长”、未加工的FTL以及由细胞中的加工产生的FTL 的任何形式。该术语还包括天然存在的FTL变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人FTL的核苷酸序列示于SEQ ID NO:10中。由人FTL编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:42中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“GCLM”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然GCLM(谷氨酰胺-半胱氨酸连接酶,修饰亚基)。该术语包括“全长”、未加工的GCLM以及由细胞中的加工产生的GCLM的任何形式。该术语还包括天然存在的GCLM变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人GCLM的核苷酸序列示于 SEQ ID NO:11中。由人GCLM编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:43中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“GSR”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然GSR(谷胱甘肽还原酶)。该术语包括“全长”、未加工的GSR以及由细胞中的加工产生的GSR的任何形式。该术语还包括天然存在的GSR变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人GSR的核苷酸序列示于SEQ ID NO:12中。由人GSR编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:44中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“KYNU”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然KYNU(犬尿氨酸酶)。该术语包括“全长”、未加工的KYNU以及由细胞中的加工产生的KYNU的任何形式。该术语还包括天然存在的KYNU变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人KYNU的核苷酸序列示于SEQ ID NO:13中。由人KYNU 编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:45中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“ME1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然ME1(苹果酸酶1,NADP(+)-依赖性的,细胞溶质的)。该术语包括“全长”、未加工的ME1以及由细胞中的加工产生的ME1的任何形式。该术语还包括天然存在的ME1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人ME1的核苷酸序列示于SEQ ID NO:14中。由人ME1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:46中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“NFE2L2”或“NRF2”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然NFE2L2或NRF2(核因子,红细胞样2-2)。该术语包括“全长”、未加工的NFE2L2以及由细胞中的加工产生的NFE2L2的任何形式。该术语还包括天然存在的 NFE2L2变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人NFE2L2的核苷酸序列示于SEQ ID NO:15中。由人NFE2L2编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:47中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“NQO1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然NQO1(NAD(P)H脱氢酶,醌1)。该术语包括“全长”、未加工的NQO1以及由细胞中的加工产生的NQO1 的任何形式。该术语还包括天然存在的NQO1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人NQO1的核苷酸序列示于SEQ ID NO:16 中。由人NQO1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 48中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“NR0B1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然NR0B1(核受体亚家族0,组B,成员1)。该术语包括“全长”、未加工的NR0B1以及由细胞中的加工产生的NR0B1的任何形式。该术语还包括天然存在的NR0B1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人NR0B1的核苷酸序列示于SEQ ID NO:17中。由人NR0B1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:49中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“OSGIN1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然OSGIN1(氧化应激诱导的生长抑制剂 1)。该术语包括“全长”、未加工的OSGIN1以及由细胞中的加工产生的OSGIN1的任何形式。该术语还包括天然存在的OSGIN1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人OSGIN1的核苷酸序列示于 SEQ ID NO:18中。由人OSGIN1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:50中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“PGD”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然PGD(磷酸葡萄糖酸脱氢酶)。该术语包括“全长”、未加工的PGD以及由细胞中的加工产生的PGD的任何形式。该术语还包括天然存在的PGD变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人PGD的核苷酸序列示于SEQ ID NO:19中。由人PGD 编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:51中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“RSPO3”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然RSPO3(R-脊椎蛋白3)。该术语包括“全长”、未加工的RSPO3以及由细胞中的加工产生的RSPO3的任何形式。该术语还包括天然存在的RSPO3变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人RSPO3的核苷酸序列示于SEQ ID NO:20中。由人RSPO3编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:52中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“SLC7A11”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然SLC7A11(溶质载体家族7(阴离子型氨基酸转运蛋白轻链,Xc-系统),成员11)。该术语包括“全长”、未加工的SLC7A11以及由细胞中的加工产生的SLC7A11的任何形式。该术语还包括天然存在的SLC7A11变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人SLC7A11的核苷酸序列示于SEQ ID NO:21中。由人SLC7A11编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:53 中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“SRXN1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然SRXN1(硫氧还蛋白1)。该术语包括“全长”、未加工的SRXN1以及由细胞中的加工产生的SRXN1的任何形式。该术语还包括天然存在的SRXN1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人SRXN1的核苷酸序列示于SEQ ID NO:22中。由人SRXN1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:54中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“TALDO1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然TALDO1(转醛醇酶1)。该术语包括“全长”、未加工的TALDO1以及由细胞中的加工产生的TALDO1的任何形式。该术语还包括天然存在的TALDO1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TALDO1的核苷酸序列示于SEQ ID NO:23 中。由人TALDO1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 55中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“TRIM16”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然TRIM16(含三重基序的16)。该术语包括“全长”、未加工的TRIM16以及由细胞中的加工产生的TRIM16 的任何形式。该术语还包括天然存在的TRIM16变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TRIM16的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 24中。由人TRIM16编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:56中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“TRIM16L”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然TRIM16L(含三重基序的16-样)。该术语包括“全长”、未加工的TRIM16L以及由细胞中的加工产生的 TRIM16L的任何形式。该术语还包括天然存在的TRIM16L变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TRIM16L的核苷酸序列示于 SEQ ID NO:25中。由人TRIM16L编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:57中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“TXN”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然TXN(硫氧还蛋白)。该术语包括“全长”、未加工的TXN以及由细胞中的加工产生的TXN的任何形式。该术语还包括天然存在的TXN变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TXN的核苷酸序列示于SEQ ID NO:26中。由人TXN编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:58中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“TXNRD1”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物 (例如,小鼠和大鼠)的任何天然TXNRD1(硫氧环蛋白还原酶1)。该术语包括“全长”、未加工的TXNRD1以及由细胞中的加工产生的 TXNRD1的任何形式。该术语还包括天然存在的TXNRD1变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TXNRD1的核苷酸序列示于 SEQ ID NO:27中。由人TXNRD1编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:59中。

如本文中所用,除非另有说明,否则术语“UGDH”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然UGDH(尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖-6-脱氢酶)。该术语包括“全长”、未加工的UGDH以及由细胞中的加工产生的UGDH的任何形式。该术语还包括天然存在的UGDH变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人UGDH的核苷酸序列示于SEQ ID NO:28中。由人UGDH编码的示例性蛋白质的氨基酸序列示于 SEQ ID NO:60中。

术语“样品”和“生物样品”可互换使用,是指从个体(包括体液、身体组织(例如,肿瘤组织)、细胞)或其它来源获得的任何生物样品。体液是例如淋巴液、血清、新鲜全血、外周血单核细胞、冷冻全血、血浆(包括新鲜或冷冻的)、尿液、唾液、精液、滑液和脊髓液。样品还包括乳腺组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓和肿瘤组织。从哺乳动物获得组织活检物和体液的方法是本领域熟知的。

“组织样品”或“细胞样品”是指从受试者或个体的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检物和/或抽吸物的实体组织;血液或任何血液成分诸如血浆;体液诸如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液;来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地,组织或细胞样品获自疾病组织/ 器官。组织样品可含有在自然界中不与组织天然混杂的化合物,诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。

如本文所用的“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”是指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自同一受试者或个体的身体的健康和 /或非患病部分(例如,组织或细胞)。例如,健康和/或非患病细胞或与患病细胞或组织相邻的组织(例如,与肿瘤相邻的细胞或组织)。在另一个实施方案中,参照样品获自同一受试者或个体的身体的未处理组织和/或细胞。在另一个实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是受试者或个体的个体的身体的健康和/或非患病部分(例如,组织或细胞)。在甚至另一个实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自非受试者或个体的身体的未治疗组织和/或细胞。在另一个实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自一种或多种细胞系(例如,一种或多种正常细胞系)。

如本文中所用,短语“鉴定患者(identifying a patient)”或“鉴定患者 (identifies a patient)”是指使用与表1中所列的基因中的至少一种的水平相关的生成的信息或数据、具有其外显子2或外显子2+3的全部或部分的缺失的NRF2mRNA或具有其Neh2或Neh2+4的全部或部分的缺失的NRF2蛋白在患者样品中的存在,来将患者鉴定或选择为更可能受益于或不太可能受益于包含NRF2途径拮抗剂的疗法。所使用或生成的信息或数据可以为任何形式(书面、口头或电子的)。在一些实施方案中,使用所生成的信息或数据包括传达、呈递、报告、存储、发送、传递、提供、传输、分配或其组合。在一些实施方案中,传达、呈递、报告、存储、发送、传递、提供、传输、分配或其组合是由计算设备、分析器单元或其组合来执行。在一些其它实施方案中,传达、呈递、报告、存储、发送、传递、提供、传输、分配或其组合是由实验室或医学专业人员来执行。在一些实施方案中,信息或数据包括表 1中所列的基因中的至少一种的水平与参照水平的比较。在一些实施方案中,信息或数据包括表1中所列的基因中的至少一种存在或不存在于样品中的指示。在一些实施方案中,信息或数据包括NRF2 mRNA具有其外显子2或外显子2+3的全部或部分的缺失的指示。在一些实施方案中,信息或数据包括NRF2蛋白具有其Neh2或 Neh2+4的全部或部分的缺失的指示。在一些实施方案中,信息或数据包括患者更可能或不太可能响应包含NRF2途径拮抗剂的疗法的指示。

术语“引物”是指单链多核苷酸,其能够与核酸杂交并允许互补核酸聚合(通常通过提供游离的3'-OH基团)。

如本文中所用,术语“治疗(treatment)”(及其语法变化形式,诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的天然病程的临床介入,且可为了预防或在临床病理学过程中而进行。理想的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发性、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态以及缓和或改善预后。在一些实施方案中,本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文中所用,“施用”意指向受试者施用一定剂量的化合物(例如,NRF2途径拮抗剂)的方法。本文所述方法中使用的组合物可以例如通过玻璃体内(例如,通过玻璃体内注射)、通过滴眼、肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内(intraprostatically)、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中的途径进行施用。用于本文所述方法中的组合物还可以以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根据各种因素(例如,所施用的化合物或组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。

试剂(例如,药物制剂)的“有效量”是指以剂量和在需要的时间段内能有效获得所需的治疗或预防结果的量。

本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且包括各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们显示出所需的抗原-结合活性。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比,并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现,所述方式例如使用可公开获得的计算机软件,诸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。然而,出于本文目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性%值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创造,且原始码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)备案,其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.公开获得,或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上。所有序列比较参数皆由ALIGN-2程序设置且不改变。

在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情形下,给定氨基酸序列A 对于、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性%(其可选地表述为对于、与或针对给定的氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性%的给定氨基酸序列A)如下计算:

100×分数X/Y

其中X为在对A与B进行该程序比对时由序列比对程序 ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数目,且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应了解,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B 的长度的情况下,A与B的氨基酸序列同一性%将不等于B与A的氨基酸序列同一性%。除非另外特定陈述,否则本文中所使用的所有氨基酸序列同一性%值使用ALIGN-2计算机程序如前一段落中所描述而获得。

术语“抗肿瘤的”是指可用于治疗癌症的组合物,其包含至少一种活性治疗剂,例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于,例如,化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射治疗中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其它药剂,诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如,酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼 (TARCEVATM))、血小板衍生生长因子抑制剂(例如,GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如,塞来昔布)、干扰素、细胞因子、拮抗剂(例如,中和抗体),其与一种或多种以下靶标结合:ErbB2、 ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或一种或多种VEGF 受体、TRAIL/Apo2和其它生物活性和有机化学试剂等等。其组合物也包括在本发明中。

如本文中所用,术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如,At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和 Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如,甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂);生长抑制剂;酶及其片段如溶核酶、抗生素、毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素,包括其片段和/或变体,以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。

“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化合物。“化学治疗剂”的实例包括用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂,诸如,例如替莫唑胺(TMZ)、烷化剂达卡巴嗪的咪唑四嗪衍生物。化学治疗剂的另外实例包括例如紫杉醇或托泊替康或聚乙二醇化脂质体多柔比星(PLD)。化学治疗剂的其它实例包括烷化剂诸如噻替派和环磷酰胺;烷基磺酸盐,诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶类诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派;乙烯亚胺类和甲基蜜胺类,包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑憐酸胺、三乙撑硫代憐酸胺和三轻甲蜜胺;番蒸枝内酯类(尤其是布拉他辛 (bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱;苔藓抑素; callystatin;CC_1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀;多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉碱;匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵抑制素;氮芥类,诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酸胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴 (novembichin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、鸟嘧啶氮芥;亚硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素诸如烯二炔类(enediyne) 抗生素(例如,加利车霉素,尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1 (参见,例如,Agnew,Chem.Intl.编辑Engl.,33:183-186(1994));达内霉素,包括达内霉素A;二膦酸盐类,诸如氯膦酸盐;埃斯波霉素;以及新制癌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星)、洋红霉素、嗜癌霉素)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星)、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素)、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙;嘌呤类似物,诸如氟达拉滨、6-疏基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨)和氟尿苷;雄激素类,诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯;抗肾上腺类,诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂,诸如亚叶酸;醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;恩尿嘧啶;安吖啶;贝他布昔;比生群;依达曲沙;地磷酰胺;地美可辛;地吖醌;依氟鸟氨酸;依利醋铵;埃博霉素;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;氯尼达宁;类美登素,诸如美登素和安丝菌素;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;硝嗪;喷司他丁;苯来美特;吡柔比星;洛索蒽醌;足叶草酸;2-乙基酰肼;甲基苄肼;多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);雷佐;利索新 (rhizoxin);西佐喃;锗螺胺;替奴佐酸;三亚胺醌;2,2',2”-三氯三乙胺;单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉可瑞A、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛;达卡巴嗪;甘露醇氮芥;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;加托因;阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替哌;紫衫烷类,例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、不含Cremophor、紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒制剂 (American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和多西紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;铂类似物,如顺铂、奥沙利铂和卡铂;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺消灵 (novantrone);替尼泊苷;依达曲沙;柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达;伊班膦酸盐;伊立替康(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维生素A,诸如维甲酸;卡培他滨;考布他丁;甲酰四氢叶酸(LV);奥沙利铂,包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX);拉帕替尼(Tykerb.RTM.);PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如,厄洛替尼(Tarceva.RTM.))和降低细胞增殖的VEGF和任何上述药剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

术语“程序化死亡配体1”和“PD-L1”在本文中是指天然序列 PD-L1多肽、多肽变体和天然序列多肽和多肽变体的片段。本文所述的PD-L1多肽可以是从多种来源分离的(诸如来自人组织类型或来自另一个来源),或通过重组或合成方法制备的PD-L1多肽。

术语“PD-L1轴结合拮抗剂”是指抑制PD-L1轴结合配偶体与其结合配偶体的一种或多种相互作用,以便去除由在PD-1信号传导轴上发信号引起的T细胞功能障碍,结果恢复或增强T细胞功能的分子。如本文中所用,PD-L1轴结合拮抗剂包括PD-L1结合拮抗剂和 PD-1结合拮抗剂以及干扰PD-L1与PD-1之间相互作用的分子(例如, PD-L2-Fc融合物)。

如本文所用,“PD-L1结合拮抗剂”是减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合伴侣中的一种或多种(诸如PD-1和/或B7-1) 的相互作用所产生的信号传导的分子。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伴侣的结合的分子。在具体方面, PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽、小分子拮抗剂、多核苷酸拮抗剂以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合伴侣中的一种或多种(诸如PD-1和/或B7-1)的相互作用所产生的信号传导的其它分子。在一个实施方案中,PD-1结合拮抗剂减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的和其它细胞通过PD-1或PD-L1介导的信号传导的负信号,使得功能失调性T细胞成为较少功能失调的。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在具体方面,抗PD-L1抗体是YW243.55.S70。在另一个具体方面,抗PD-L1抗体是MDX-1105。在另一个具体方面,抗PD-L1抗体是阿替珠单抗 (atezolizumab)(MPDL3280A)。在另一个具体方面,抗PD-L1抗体是 MEDI4736(阿替珠单抗)。在又一个具体方面,抗PD-L1抗体是 MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))。

如本文所用,“PD-1结合拮抗剂”是减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合伴侣中(诸如PD-L1和/或PD-L2)的一种或多种的相互作用所产生的信号传导的分子。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其结合伴侣的结合的分子。在具体方面,PD-1 结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如,PD-L1 结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽、小分子拮抗剂、多核苷酸拮抗剂以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用所产生的信号传导的其它分子。在一个实施方案中,PD-1结合拮抗剂减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的和其它细胞通过 PD-1或PD-L1介导的信号传导的负信号,使得功能失调性T细胞成为较少功能失调的。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂为抗PD-1 抗体。在具体方面,PD-1结合拮抗剂为MDX-1106(纳武单抗)。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为MK-3475(派姆单抗)。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为CT-011(皮地利珠单抗)。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为MEDI-0680(AMP-514)。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为PDR001。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为本文所述的REGN2810。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为本文所述的BGB-108。在另一个具体方面,PD-1结合拮抗剂为AMP-224。

术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”是指血管内皮生长因子。术语“VEGF”包括其同源物和同种型。术语“VEGF”还包括VEGF的已知同种型,例如剪接同种型,例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、 VEGF189、和VEGF206,以及其天然存在的等位基因和加工的形式,包括通过VEGF165的纤溶酶裂解产生的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子,如Ferrara Mol.Biol.Cell.21:687(2010),Leung等, Science,246:1306(1989)和Houck等,Mol.Endocrin.,5:1806(1991)中所述。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时,来自特定物种的VEGF由诸如人VEGF的hVEGF、鼠VEGF的mVEGF等术语表示。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8至109或1至109的多肽的截短形式。可以在本申请中鉴定对VEGF的任何此类形式的提及,例如,通过“VEGF109”、“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置按天然VEGF序列中所示进行编号。例如,截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF对KDR 和Flt-1受体具有与天然VEGF相当的结合亲和力。如本文中所用,术语“VEGF变体”是指VEGF多肽,其在天然VEGF序列中包含一个或多个氨基酸突变。任选地,一个或多个氨基酸突变包括氨基酸取代。出于本文所述的VEGF变体的简化名称的目的,注意数字是指沿着推定的天然VEGF的氨基酸序列的氨基酸残基位置(Leung等,同上和 Houck等,同上中提供的)。

如本文中所用,术语“VEGF拮抗剂”是指能够结合VEGF,降低 VEGF表达水平,或中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(包括但不限于,VEGF与一种或多种VEGF受体的结合、VEGF 信号传导和VEGF介导的血管生成和内皮细胞存活或增殖)的分子。例如,能够中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的分子可通过与一种或多种VEGF受体(VEGFR)(例如VEGFR1、 VEGFR2、VEGFR3、膜结合的VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF 受体(sVEGFR))结合而发挥其作用。可用于本发明方法的VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、受体分子和与VEGF特异性结合,从而隔离其与一种或多种受体的结合的衍生物、融合蛋白(例如,VEGF-Trap(Regeneron))和VEGF121- 白树霉素(Peregrine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗剂变体、与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚物、与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的小RNA、靶向VEGF的核酶、针对VEGF的肽体(peptibody)和VEGF适体。 VEGF拮抗剂还包括结合VEGFR的多肽、抗VEGFR抗体及其抗原结合片段,以及结合VEGFR从而阻断、抑制、消除、减少或干扰 VEGF生物学活性(例如,VEGF信号传导)的衍生物,或融合蛋白。VEGF拮抗剂还包括与VEGF或VEGFR结合并且能够阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的非肽小分子。因此,术语“VEGF 活性”特别地包括VEGF介导的VEGF的生物学活性。在某些实施方案中,VEGF拮抗剂使VEGF的表达水平或生物活性降低或抑制至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在一些实施方案中,VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、 VEGF(1-109)或VEGF165。

如本文中所用,VEGF拮抗剂可包括但不限于抗VEGFR2抗体和相关分子(例如,雷莫芦单抗、tanibirumab、阿普西柏)、抗VEGFR1 抗体和相关分子(例如,依库单抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye;)和ziv-阿柏西普(VEGF Trap;)、双特异性VEGF抗体(例如,MP-0250、vanucizumab(VEGF-ANG2)和 US 2001/0236388中公开的双特异性抗体)、双特异性抗体,包括以下抗体中的两种的组合:抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂、抗 VEGF抗体(例如贝伐单抗、赛伐珠单抗和雷珠单抗),和非肽小分子 VEGF拮抗剂(例如,帕唑帕尼、阿西替尼、凡德他尼、瑞戈非尼 (stivarga)、卡赞替尼(cabozantinib)、乐伐替尼、尼达尼布(nintedanib)、 orantinib、拉帕替尼(telatinib)、多韦替尼(dovitinig)、西地尼布 (cediranib)、莫替沙尼(motesanib)、索凡替尼(sulfatinib)、阿帕替尼 (apatinib)、福替尼(foretinib)、法米替尼(famitinib)和替沃扎尼 (tivozanib))。

术语“抗VEGF抗体”、“与VEGF结合的抗体”和“特异性结合 VEGF的抗体”是指这样的抗体,其能够以足够的亲和力结合VEGF,使得该抗体可用作靶向VEGF的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中,如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的,抗VEGF抗体与不相关的非VEGF蛋白的结合程度低于约10%的抗体与VEGF结合。在某些实施方案中,与VEGF结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10 nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如,10-8M或更小,例如,10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗VEGF抗体与VEGF的表位结合,所述表位在不同物种的VEGF之间是保守的。

在某些实施方案中,抗VEGF抗体可用作靶向和干扰其中涉及 VEGF活性的疾病或病症的治疗剂。此外,可将抗体进行其它生物活性测定,例如,以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定是本领域已知的,并且取决于靶抗原和抗体的预期用途。实例包括HUVEC抑制测定;肿瘤细胞生长抑制测定(例如,如WO 89/06692中所述的);抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定(美国专利第5,500,362号);和激动活性或造血作用分析(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不与其它VEGF同源物诸如VEGF-B或VEGF-C 结合,也不与其它生长因子诸如PIGF、PDGF或bFGF结合。在一个实施方案中,抗VEGF抗体是单克隆抗体,其与由杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同的表位。在另一个实施方案中,抗VEGF抗体是根据Presta等(1997)Cancer Res. 57:4593-4599产生的重组人源化抗VEGF单克隆抗体,包括但不限于称为贝伐单抗(BV;)的抗体。

抗VEGF抗体“雷珠单抗”也称为或者“rhuFab V2”是人源化、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。雷珠单抗通过标准重组技术方法在大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体和细菌发酵中产生。雷珠单抗不被糖基化,分子量约为48,000道尔顿。参见WO 98/45331 和US 2003/0190317。另外的优选抗体包括G6或B20系列抗体(例如, G6-31、B20-4.1),如PCT申请公开第WO 2005/012359号和第WO 2005/044853号(其各自通过引用整体并入本文)中所述。对于另外的优选抗体,参见美国专利第7,060,269号、第6,582,959号、第6,703,020 号、第6,054,297号;WO98/45332、WO 96/30046;WO94/10202; EP 0666868B1;美国专利申请公开第2006009360号、第20050186208 号、第20030206899号、第20030190317号、第20030203409号和第 20050112126号;和Popkov等,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。其它优选抗体包括与人VEGF上的功能性表位结合的抗体,所述功能性表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、 Q89、191、K101、E103和C104,或者包含残基F17、Y21、Q22、 Y25、D63、183和Q89。另外的抗VEGF抗体包括PCT申请公开第 WO 2009/155724号中描述的抗VEGF抗体。

术语“共施用的”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂,其中至少部分施用在时间上重叠。因此,共同施用包括在停止施用一种或多种其它药剂后继续施用一种或多种药剂时的给药方案。

如本文中所用,“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性的还是良性的)以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性疾病”、“增殖性疾病”和“肿瘤”不是如本文所提及的相互排斥的。

III.方法

A.诊断方法

本文提供了用于诊断受试者中的癌症(例如,肺癌(例如,鳞状 NSCLC或非鳞状NSCLC)或头颈癌(例如,HNSC))的方法。本文还提供了鉴定患有癌症的受试者的方法,所述癌症是NRF2依赖性癌症(例如,肺癌,例如鳞状非小细胞肺癌或非鳞状非小细胞肺癌,或头颈癌))。所述方法中的任何方法可以基于本文提供的生物标志物(例如 NRF2(例如,NRF2mRNA或NRF2蛋白)的剪接变体)的表达水平,或一种或多种NRF2靶基因的增加的表达。所述方法中的任何方法可进一步包括向受试者施用NRF2途径拮抗剂。所述方法中的任何方法可进一步包括向受试者施用有效量的第二治疗剂(例如,一种或多种 (例如,1种、2种、3种或4种或更多种)另外的NRF2途径拮抗剂或一种或多种(例如,1种、2种、3种或4种或更多种)抗癌剂)。

本发明提供了诊断受试者中的癌症的方法,该方法包括:(a)测定获自所述受试者的样品中选自由以下组成的组的至少一种基因(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、 11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、 20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种或27种基因)的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL;以及将所述至少一种基因的表达水平与所述至少一种基因的参照表达水平进行比较,其中样品中所述至少一种基因的表达水平相对于所述至少一种基因的参照表达水平的升高鉴定患有癌症的受试者。

本发明还提供了鉴定患有为NRF2依赖性癌症的癌症的受试者的方法,该方法包括测定获自所述受试者的样品中选自由以下组成的组的至少一种基因(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、 8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17 种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26 种或27种基因)的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、 FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、 AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、 TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL;将所述至少一种基因的表达水平与所述至少一种基因的参照表达水平进行比较;和确定所述受试者的癌症是否是NRF2依赖性癌症,其中所述样品中的所述至少一种基因的表达水平相对于所述至少一种基因的参照表达水平的升高鉴定患有NRF2依赖性癌症的受试者。

在任何先前的方法中,测定AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、 FECH、GCLM、TRIM16、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、 AKR1C4、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、 TXN或NQO1中的一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、 6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、 16种、17种、18种、19种、20种和21种)的表达水平。

在任何前述方法中,测定一种或多种(例如,(例如,1种、2种、 3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种)新鉴定的NRF2靶基因的表达水平。新鉴定的NRF2靶基因包括 AKR1B10、AKR1C2、ME1、KYNU、CABYR、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、AKR1B15、NR0B1和AKR1C3。

本发明还提供了诊断受试者中的癌症的方法,该方法包括测定获自受试者的样品(例如,肿瘤样品)中的NRF2的mRNA表达水平,所述NRF2包含其外显子2的全部或部分的缺失,其中包含其外显子2 的全部或部分的缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,NRF2还包含其外显子3的全部或部分的缺失。可以基于本领域已知的任何合适的标准(包括但不限于DNA、mRNA、 cDNA、蛋白质片段和/或基因拷贝数)定性或定量地测定基因(例如, NRF2、KEAP1、AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1或FTL)的存在和/或表达水平。

本发明还提供了鉴定受试者中的癌症的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的NRF2的蛋白质表达水平,所述NRF2包含其 Neh2结构域的全部或部分的缺失,其中包含其Neh2结构域的全部或部分的缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,NRF2还包含其Neh4的全部或部分的缺失。

本发明还提供了鉴定患有癌症的受试者的方法,该方法包括测定获自受试者的样品(例如,肿瘤样品)中的NRF2的mRNA表达水平,所述NRF2包含其外显子2的全部或部分的缺失,其中包含其外显子 2的全部或部分的缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,NRF2还包含其外显子3的全部或部分的缺失。可以基于本领域已知的任何合适的标准(包括但不限于DNA、mRNA、cDNA、蛋白质片段和/或基因拷贝数)定性或定量地测定基因(例如, NRF2、KEAP1、AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1或FTL)的存在和/或表达水平。

本发明还提供了鉴定患有癌症的受试者的方法,该方法包括测定获自受试者的样品中的NRF2的蛋白质表达水平,所述NRF2包含其 Neh2结构域的全部或部分的缺失,其中包含其Neh2结构域的全部或部分的缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症。在一些实施方案中,NRF2还包含其Neh4结构域的全部或部分的缺失。

可以通过许多方法分析样品中本文所述的各种生物标志物的存在和/或表达水平/量,所述方法中的许多方法是本领域已知的并且是技术人员所理解的,包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、基于定量血液的分析(例如,血清ELISA)、生化酶活性测定、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、 DNA分析、RNA分析、全基因组测序、大规模平行DNA测序(例如,新一代测序)、聚合酶链反应(PCR),包括定量实时 PCR(qRT-PCR)和其它扩增类型检测方法,诸如,例如,分枝状DNA、 SISBA、TMA等、RNA测序、微阵列分析、基因表达谱分析和/或基因表达系列分析(“SAGE”),以及可通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的多种测定中的任何一种。用于评估多种基因和基因产物的状态的典型方案见于例如Ausubel等,编辑,1995,Current Protocols In Molecular Biology,第2单元(RNA印迹)、第4单元(DNA印迹)、第15单元(免疫印迹)和第18单元(PCR分析)。还可使用多重免疫测定,诸如可从Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(“MSD”) 获得的那些多重免疫测定。

在本文所述任何方法的一些实施方案中,可使用下一代测序方法,诸例如Frampton等(Nature Biotechnology.31(11):1023-1033, 2013)(其通过引用整体并入本文)中描述的靶向基因下拉和测序方法对来自临床肿瘤样品的DNA进行测序。可将此种下一代测序方法与本文公开的任何方法一起使用以检测各种突变(例如,插入、缺失、碱基取代、局部基因扩增和/或纯合基因缺失),同时允许使用小样品 (例如,来自小芯针穿刺活检、细针穿刺和/或细胞块)或固定的样品(例如,福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的样品)。

在任何前述方法中,生物标志物的存在和/或表达水平/量(例如, NRF2、KEAP1、AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1或FTL)通过测定生物标志物的蛋白质表达水平来测量。在某些实施方案中,该方法包括在允许生物标志物结合的条件下使生物样品与特异性结合生物标志物的抗体(例如,抗-NRF2抗体)接触,并检测所述抗体与生物标志物之间是否形成复合物。此类方法可为体外或体内方法。可以使用本领域已知的或本文提供的测量蛋白质表达水平的任何方法。例如,在一些实施方案中,使用选自由以下组成的组的方法测定生物标志物的蛋白质表达水平:流式细胞术(例如,荧光激活细胞分选(FACSTM))、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光光谱学、质谱和HPLC。在一些实施方案中,在肿瘤细胞中测定生物标志物的蛋白质表达水平。

在一些实施方案中,生物标志物的存在和/或表达水平/量(例如, NRF2、KEAP1、AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1或FTL)通过测定生物标志物的mRNA表达水平来测量。在某些实施方案中,使用方法测定基因的存在和/或表达水平/量,所述方法包括:(a)对样品(诸如受试者癌症样品)进行基因表达谱分析、PCR(例如RT-PCR)、RNA测序、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术或FISH;b)测定样品中生物标志物的存在和/或表达水平/量。在一个实施方案中,PCR方法是 qRT-PCR。在一个实施方案中,PCR方法是多重-PCR。在一些实施方案中,通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中,通过qRT-PCR 测量基因表达。在一些实施方案中,通过多重-PCR测量表达。

用于评估细胞中mRNA的方法是众所周知的,包括例如使用互补DNA探针的杂交测定(诸如使用对一种或多种基因特异的标记的核糖核酸探针进行的原位杂交、RNA印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定(诸如使用对一种或多种基因特异的互补引物的RT-PCR,和其它扩增类型检测方法,诸如,例如支链DNA、SISBA、TMA等)。可以使用RNA、斑点印迹或PCR分析方便地测定来自哺乳动物的样品的mRNA。另外,此类方法可包括一个或多个步骤,其允许测定生物样品中靶mRNA的水平(例如,通过同时检查“管家”基因(诸如肌动蛋白家族成员)的比较对照mRNA序列的水平)。

在任何方法的一些实施方案中,生物标志物是NRF2(例如,外显子2缺失的NRF2或外显子2+3缺失的NRF2)。在一个实施方案中,使用方法测定生物标志物的表达水平,所述方法包括对样品(例如从患者获得的肿瘤样品)进行WGS分析并测定样品中生物标志物的表达水平。在一些实施方案中,相对于参照测定外显子2缺失的NRF2 或外显子2+3缺失的NRF2的存在。在一些实施方案中,所述参照为参照值。在一些实施方案中,所述参照是参照样品(例如,对照细胞系样品、来自非癌症患者的组织样品或野生型NRF2组织样品)。

除了mRNA表达分析以外或作为另外一种选择,可以根据上述方法定量其它生物标志物,诸如蛋白质表达。例如,本发明的方法包括测试样品的基因组生物标志物(例如,外显子2缺失的NRF2或外显子2+3缺失的NRF2的存在,或一种或多种NRF2靶基因(AKR1B10、 AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、TRIM16、ME1、KYNU、 CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、ABCC2、 AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、GSR、AKR1C3、TALDO1、 PGD、TXN、NQO1或FTL)的上调,并且另外测试样品的蛋白质生物标志物(例如,AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1或FTL中的一种或多种蛋白质的蛋白质转录物)。

在任何方法的一些实施方案中,DNA序列可以用作生物标志物。可以根据本领域已知的任何方法定(包括但不限于PCR、外显子组测定(例如,全外显子组测序)、DNA微阵列分析、或全基因组测序)量DNA。

在一些情况下,样品中基因的表达水平是基因的平均值(例如,平均表达或中位表达),所述基因的参照考表达水平是所述参照的所述基因的平均值(例如,平均表达或中位表达),并且将样品的所述基因的平均值与所述参照的所述基因的平均值进行比较。

在某些实施方案中,与第二样品中的存在/不存在和/或表达水平/ 量相比,第一样品中生物标志物的存在和/或表达水平/量得以增加或升高。在某些实施方案中,与第二样品中的存在和/或表达水平/量相比,第一样品中生物标志物的存在/不存在和/或表达水平/量得以减少或降低。在某些实施方案中,第二样品是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织。本文中描述了用于确定基因的存在/不存在和/或表达水平/量的其它公开内容。

在某些实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自同一受试者或个体的单个样品或组合的多个样品,在与获得测试样品的时间不同的一个或多个时间点获得所述样品。在某些实施方案中,在比获得测试样品的时间更早的时间,从同一受试者或个体获得参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织。如果在癌症的初始诊断期间获得参照样品并且随后在癌症变为转移时获得测试样品,则此类参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以是有用的。

在某些实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自一个或多个非患者的健康个体的组合的多个样品。在某些实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自一个或多个不为所述受试者或个体的患有疾病或病症(例如,癌症)的个体的组合的多个样品。在某些实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自一个或多个非患者的个体的正常组织或合并的血浆或血清样品。在某些实施方案中,参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自一个或多个不为所述患者的患有疾病或病症(例如,癌症)的个体的肿瘤组织或合并和血浆或血清样品。

在任何方法的一些实施方案中,升高或增加的表达是指通过本领域已知的标准方法(诸如本文所述的那些方法)检测的相较于参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织的生物标志物(例如,蛋白质或核酸(例如,基因(DNA或mRNA)))水平的约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或更多中的任一百分比的总体增加。在某些实施方案中,升高的表达是指样品中生物标志物的表达水平/量的增加,其中所述增加为参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中的相应生物标志物的表达水平/量的至少约1.5倍、1.75 倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、 50倍、75倍或100倍中的任何倍数。在一些实施方案中,升高的表达是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、对照组织或内部对照(例如,管家基因)相比的大于约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍或约3.25倍的总体增加。

在任何方法的一些实施方案中,降低的表达是指通过本领域已知的标准方法(诸如本文所述的那些方法)检测的相较于参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织的生物标志物(例如,蛋白质或核酸(例如,基因(DNA或mRNA)))水平的约10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或更多中的任一百分比的总体下降。在某些实施方案中,降低的表达是指样品中生物标志物的表达水平/量的减少,其中所述减少为参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中的相应生物标志物的表达水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6 倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍中的任何倍数。

B.治疗方法

本发明提供了用于治疗患有(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)或头颈癌(例如,HNSC))的患者的方法。在某些情况下,本发明的方法包括向患者施用有效量的NRF2途径拮抗剂。本文所述的或本领域已知的任何NRF2途径拮抗剂均可用于该方法中。在一些情况下,该方法涉及例如,使用本文中、以下实施例中描述的或本领域已知的方法中的任何方法,确定获自患者的样品中NRF2剪接变体(例如,外显子2缺失的NRF2或外显子2+3缺失的NRF2)或NRF2 靶基因的存在和/或表达水平,并基于NRF2剪接变体(例如,外显子 2缺失的NRF2或外显子2+3缺失的NRF2)或NRF2靶基因的存在和 /或表达水平向患者施用NRF2途径拮抗剂。

本发明提供了治疗患有癌症(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)或头颈癌(例如,HNSC))的受试者的方法,该方法包括测定获自所述受试者的样品中选自由以下组成的组的至少一种基因(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10 种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19 种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种或27种基因) 的表达水平:AKR1B10、AKR1C2、SRXN1、OSGIN1、FECH、GCLM、 TRIM16、ME1、KYNU、CABYR、SLC7A11、TRIM16L、AKR1C4、 CYP4F11、RSPO3、ABCC2、AKR1B15、NR0B1、UGDH、TXNRD1、 GSR、AKR1C3、TALDO1、PGD、TXN、NQO1和FTL;以及将所述至少一种基因的表达水平与所述至少一种基因的参照表达水平进行比较,其中样品中所述至少一种基因的表达水平相对于所述至少一种基因的参照表达水平的升高鉴定患有癌症的受试者,以及向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种NRF2途径拮抗剂。

本发明还提供了治疗患有癌症(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC 或非鳞状NSCLC)或头颈癌)的受试者的方法,其中测定一种或多种 (例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10 种、11种或12种)新鉴定的NRF2靶基因的表达水平。新鉴定的NRF2 靶基因包括AKR1B10、AKR1C2、ME1、KYNU、CABYR、TRIM16L、 AKR1C4、CYP4F11、RSPO3、AKR1B15、NR0B1和AKR1C3。

在一些情况下,本发明还提供了治疗患有癌症(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)或头颈癌)的受试者的方法,其中获自受试者的样品中的NRF2的mRNA表达水平包含其外显子2的全部或部分的缺失,并且其中包含其外显子2的全部或部分的缺失的 NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症;以及向受试者施用治疗有效量的一种或多种NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,NRF2还包含其外显子3的全部或部分的缺失。

在一些情况下,本发明还提供了治疗患有癌症(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)或头颈癌(例如,HNSC))的受试者的方法,其中获自受试者的样品中的NRF2蛋白包含其Neh2结构域的全部或部分的缺失,并且其中包含其Neh2结构域的全部或部分的缺失的NRF2的存在将受试者鉴定为患有癌症;以及向受试者施用治疗有效量的一种或多种NRF2途径拮抗剂。在一些实施方案中,NRF2 还包含其Neh4结构域的全部或部分的缺失。

在任何前述方法中,NRF2途径拮抗剂可以是本领域已知的或本文描述的任何NRF2途径拮抗剂。

在一些情况下,所述方法还包括向受试者施用有效量的第二治疗剂(例如,一种或多种抗癌剂)。在一些情况下,抗癌剂选自由以下组成的组:抗血管生成剂、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、免疫疗法及其组合。在一些实施方案中,免疫疗法是VEGF拮抗剂(例如,抗VEGFR2抗体和相关分子(例如,雷莫芦单抗、tanibirumab、阿普西柏)、抗VEGFR1抗体和相关分子(例如,依库单抗、阿柏西普(VEGF Trap-Eye;)和ziv-阿柏西普(VEGF Trap;))、双特异性VEGF抗体(例如,MP-0250、vanucizumab(VEGF-ANG2)和 US 2001/0236388中公开的双特异性抗体)、双特异性抗体,包括以下抗体中的两种的组合:抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂、抗 VEGF抗体(例如贝伐单抗、赛伐珠单抗和雷珠单抗),和非肽小分子 VEGF拮抗剂(例如,帕唑帕尼、阿西替尼、凡德他尼、瑞戈非尼、卡赞替尼、乐伐替尼,尼达尼布、orantinib、拉帕替尼、多韦替尼、西地尼布、莫替沙尼、索凡替尼、阿帕替尼、福替尼、法米替尼和替沃扎尼))。在其它实施方案中,免疫疗法是PD-1轴结合拮抗剂(例如, YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MEDI4736 (度伐单抗(druvalumab))、MSB0010718C(阿维单抗)、MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、CT-011(皮地利珠单抗)、MEDI-0680 (AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108或AMP-224)。

本文所述方法中使用的组合物(例如,NRF2途径拮抗剂)可以通过任何合适的方法施用,包括例如静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内(intraprostatically)、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、玻璃体内(例如,通过玻璃体内注射)、通过滴眼、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中的途径进行施用。用于本文描述的方法中的组合物还可以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根据各种因素(例如,所施用的化合物或组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。部分地根据施用是短暂的还是长期的,给药可通过任何适合的途径进行,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射。本文设想了各种给药时间表,包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。

本文所述的NRF2途径拮抗剂(和任何另外的抗癌剂)可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用排程和医学从业者已知的其它因素。NRF2途径拮抗剂不必与,但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的Nrd2途径抑制剂的量、病症或治疗的类型,以及上面讨论的其它因素。这些药剂通常以如本文所述的相同剂量以及用如本文所述的施用途径,或以本文所述的剂量的约 1%至99%,或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验 /临床上确定为适当的任何途径加以使用。

在一些实施方案中,所述方法还包括向患者施用有效量的第二治疗剂(例如,一种或多种抗癌剂)。在一些实施方案中,抗癌剂选自由以下组成的组:抗血管生成剂、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、免疫疗法及其组合。

上述此类联合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂(例如,NRF2途径拮抗剂和抗癌剂)包括在相同或分开的制剂中)和单独施用,在该情况下,NRF2途径拮抗剂的施用可以在施用所述另外的抗癌剂之前、同时和/或之后发生。在一个实施方案中,NRF2途径拮抗剂的施用和另外的抗癌剂的施用在彼此的约一个月内,或在约1 周、2周或3周内,或在约1天、2天、3天、4天、5天或6天内发生。

C.用于本发明方法的NRF2途径拮抗剂

本文提供了用于治疗或延迟受试者中癌症(例如,肺癌(例如,鳞状NSCLC)或头颈癌)的进展的方法,其包括向受试者施用治疗有效量的NRF2途径拮抗剂。任何前述方法可以基于本文提供肿瘤样品(例如含有肿瘤细胞的活检物)的生物标志物的表达水平,例如,NRF2表达或NRF2途径中涉及的任何蛋白质或mRNA的表达。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂是小分子,例如能够结合 NRF2的小分子或调节NRF2的表达、稳定性或活性的蛋白质或基因。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂为NRF2激动剂的拮抗剂。 NRF2激动剂的实例包括但不限于cAMP应答元件结合蛋白(CREB)、 CREB结合蛋白(CBP)、Maf、激活转录因子4(ATF4)、蛋白激酶C (PKC)、Jun、糖皮质激素受体、UbcM2,以及含有E6-AP羧基末端结构域和锚定蛋白重复序列的E3遍在蛋白蛋白连接酶1的同源物 (HACE1)。因此,NRF2途径拮抗剂的实例包括但不限于CREB拮抗剂、CBP拮抗剂、Maf拮抗剂、ATF4拮抗剂、PKC拮抗剂、Jun拮抗剂、糖皮质激素受体拮抗剂、UbcM2拮抗剂和HACE1拮抗剂,诸如表2中所列的那些。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂为NRF2拮抗剂的激动剂。 NRF2拮抗剂的实例包括但不限于c-Myc、SUMO、KEAP1、CUL3、视黄酸受体α(RARα)。因此,NRF2途径拮抗剂的实例包括但不限于c-Myc激动剂、SUMO、KEAP1激动剂、CUL3激动剂和RARα激动剂,诸如表3中列出的那些。

表2.

表3.

在本发明的一些实施方案中,表2或3中列出的化合物的衍生物也可以作为NRF2途径拮抗剂施用。表2或3中列出的化合物的衍生物是结构与母体化合物不同的小分子,但保留了拮抗NRF2途径的能力。化合物的衍生物可以相对于母体化合物改变其与某些其它分子或蛋白质的相互作用。化合物的衍生物还可包括母体化合物的盐、加合物或其它变体。在本发明的一些实施方案中,可以使用本文所述化合物(例如,表2或3中列出的化合物的任何一种化合物)的任何衍生物代替母体化合物。在一些实施方案中,表2或3中列出的化合物的任何衍生物可用于治疗患有癌症(诸如肺癌)的受试者的方法中。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂是抗体(例如,抗-NRF2抗体或针对调节NRF2表达、稳定性或活性的蛋白质或基因(例如表2 或3中列出的靶标)的抗体)。在一些实施方案中,抗-NRF2抗体能够抑制NRF2与抗氧化应答元件之间的结合。在一些实施方案中,抗 -NRF2抗体能够抑制NRF2与辅助因子(例如,Maf、PKC、Jun、ATF4 或CBP)之间的结合。在一些实施方案中,本发明的抗体是选自由以下组成的组的抗体片段:Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。在一些实施方案中,所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是人抗体。在一些实施方案中,抗体是具有任何上述特性的已知抗体的衍生物。抗体的衍生物包括与其亲本具有约99%、98%、97%、96%、 95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%或更低序列同一性的抗体变体。百分比(%)氨基酸序列同一性根据本领域已知的方法测定,包括通过如上所述的ALIGN-2来测定。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂包括任何下游生物标志物的抑制剂(例如,基因或蛋白质,例如参与铁螯合(例如,铁蛋白、轻多肽(FTL)、铁蛋白、重多肽1(FTH)或血红素加氧酶1(HMOX1))、 GSH利用(例如,谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)、谷胱甘肽S-转移酶α1(GSTA1)、谷胱甘肽S-转移酶α2(GSTA2)、谷胱甘肽S-转移酶α3 (GSTA3)、谷胱甘肽S-转移酶α5(GSTA5)、谷胱甘肽S-转移酶Mu1 (GSTM1)、谷胱甘肽S-转移酶Mu2(GSTM2)、谷胱甘肽S-转移酶 Mu3(GSTM3)或谷胱甘肽S-转移酶Pi 1(GSTP1))、奎宁解毒(例如, NAD(P)H脱氢酶、醌1(NQO1))、GSH产生和再生(例如,谷氨酸- 半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基 (GCLC)、谷胱甘肽还原酶(GSR)或溶质载体家族7(阴离子氨基酸转运蛋白轻链,Xc-系统)、成员11(SLC7A11或XCT))、硫氧还蛋白(TXN) 的产生、再生和利用(例如,硫氧还蛋白1(TXN1)、硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)或过氧化物酶(Peroxiredoxin)1(PRDX1))、NADPH产生(例如,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)、细胞溶质中的NADP(+)-依赖性、苹果酸酶(ME1)、可溶性的异柠檬酸脱氢酶1(NADP+)(IDH1))的基因或蛋白质,或表1的基因或其蛋白质中的任一种)。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂包括抑制(例如,通过竞争性结合NRF2上的ARE结合位点,通过竞争性结合ARE,或通过其它方式干扰转录辅因子(例如,小的Maf蛋白))NRF2与抗氧化应答元件(ARE)结合的化合物。

在一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂包括NRF2相关基因的激动剂或拮抗剂,使得化合物的药理学作用涉及NRF2介导的转录下游的一个或多个途径的下调。此类NRF2相关基因包括例如Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)、外胚层神经皮质1(具有BTB结构域)(ENC1)、蛋白激酶C、δ(PRKCD)、蛋白激酶C、β(PRKCB)、多胺调节因子1(PMF1)、Cullin 3(CUL3)、核因子、红细胞2(NFE2)、激活转录因子4(ATF4)、血红素加氧酶1(HMOX1)、血红素加氧酶2 (HMOX2)、遍在蛋白C(UBC)、V-Maf禽肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物K(MAFK)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族、多肽A6(UGT1A6)、 V-Maf禽肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物F(MAFF)、CREB结合蛋白(CREBBP)、V-Maf禽肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物G(MAFG)、 CAMP响应元件结合蛋白1(CREB1)、含FXYD结构域的离子转运调节因子2(FXYD2)、Jun原癌基因(JUN)、小遍在蛋白样修饰剂 2(SUMO2)、小遍在蛋白样修饰因子1(SUMO1)、V-Myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源物(MYC)、晶体蛋白(Crystallin)、ζ(醌还原酶)(CRYZ)、醛-酮还原酶家族7、成员A2(黄曲霉毒素醛还原酶)(AKR7A2)和谷胱甘肽S-转移酶α2(GSTA2)。

在一些实施方案中,提供了增加细胞中NRF2泛素化的方法,该方法包括在允许抑制细胞中的NRF2途径的条件下使细胞与NRF2途径的抑制剂接触。可以例如按照已知方法,通过在胰蛋白酶消化后免疫亲和富集泛素化的NRF2,然后进行质谱分析来测定增加的NRF2 泛素化。在一些实施方案中,遍在蛋白的增加可以通过将与NRF2途径拮抗剂接触的细胞或细胞群中的野生型NRF2的泛素化与与NRF2 途径拮抗剂接触的细胞或细胞群体中的缺失外显子2或外显子2+3 的NRF2的泛素化和/或未与NRF2途径拮抗剂接触的细胞或细胞群体中的缺失外显子2或外显子2+3的NRF2的泛素化进行比较来测定。

在本发明的一些实施方案中,NRF2途径拮抗剂是抗坏血酸、鸦胆子苦醇、木犀草素或赭曲霉毒素A。

实施例

实施例1:材料和实验方法

A.突变和拷贝数分析

对于99个NSCLC细胞系,KRas、LKB1、KEAP1和NRF2的非同义突变和拷贝数数据获自Klijn等(Nat Biotechnol.33(3):306-312,2015)。对另外13个NSCLC细胞系进行拷贝数分析。另外,将外显子组测序应用于104个NSCLC细胞系。对于癌症基因组图谱 (TCGA),使用R软件包CGDS-R(Cerami等Cancer Discovery. 2:401-404,2012;Gao等Sci.Signal.6:11,2013)从cBioPortal检索肿瘤突变和拷贝数数据。

B.突变型KEAP1基因表达标签的RNA测序分析和推导

从European Genome-phenome Archive(登录号 EGAS00001000610)(PMID:25485619)检索99个NSCLC细胞系的原始RNA测序数据。表4中提供了每种NSCLC细胞系中KEAP1和 NRF2的突变。使用GSNAP 2013-10-10版(Wu和Nacu. Bioinformatics 26:873-881,2010)从TCGA下载原始RNA测序数据并将其与人参照基因组(GRCh37/hgI9)进行比对,允许最多2个错配(参数:“-M 2-n 10-B 2-i 1-N 1-w 200000-E 1-- pairmax-rna=200000”)。用源自作图至每个RefSeq基因的读段的数目的RPKM(每千碱基靶标的读段,并且百万读段已进行了测序)值定量基因表达水平。使用DESeq R包(PMID:20979621)测量KEAP1突变型与KEAP1野生型细胞系之间的差异基因表达,报告为倍数变化和相关的调整的p值。对于样品和基因在方差上的沃德聚类(使用 Euclidean距离),使用稳定的计数数据。'NMF’R包用于生成相关的热图。

表4.

C.剪接变体分析

使用可从Bioconductor项目网站获得的SGSeq软件包(Gentleman 等Genome Biol.5:R80,2004)进行剪接变体的分析。使用参数α=2、 psi=0、β=0.2、γ=0.2,从已知癌基因的54个基因组基因座的7,384个 TCGA样品的BAM文件预测外显子和剪接点。将预测的特征在样品之间合并,并且外显子被处理成不相交的外显子箱(exon bin)。将剪接点和外显子箱组装成全基因组剪接图。从图中识别出由两个或更多个可变剪接变体组成的剪接事件。根据FPKM和相对使用率(relative usage)Ψ定量剪接变体。简言之,获得变体在开始和结束时的相对使用率的局部估计值作为与变体相容的片段的分数。使用加权平均值组合事件开始和结束时的估计值,其中权重与跨越边界的片段总数成比例。将分母小于20的相对使用率估计值设为NA。为了获得变体在开始和结束时的绝对表达的局部估计值,将相容计数n转换为FPKM (为n I(N x L)x 109),其中N是对齐的片段的总数并且L是有效长度(相容片段的允许位置数)。也在来自正常人组织的2,958个基因型-组织表达项目(GTEx)样品中定量在TCGA样品中检测到的剪接变体 (Consortium.Science.348:648-660,2015)。

D.癌症特异性剪接变体的鉴定

仅考虑内部剪接变体(不涉及可变转录物的开始或结束),并且需要每个剪接变体的开始和结束重叠或延伸属于从UCSC基因组浏览器网站(Pruitt等Nucleic Acids Res.33:D501-504,2005;Rosenbloom等 Nucleic Acids Res.43:D670-681,2015)下载的注释ref基因转录物的外显子。保留的内含子被排除在外。考虑包括至少100个癌症样品(总共6,359个癌症样品)的19个TCGA适应症,并且选择(i)在至少一个癌症样品中FPKM>2且相对使用率Ψ>0.2以及(ii)在>99.9%的GTEx 样品中FPKM<1和(iii)在>97.5%的GTE x样品中FPKM~0的剪接变体。需要在剪接变体的开始和结束时满足基于FPKM的标准。在人工检查后,包括对于其无法估计Ψ的满足基于FPKM的标准的变体。

E.靶向配对末端外显子组测序数据的分析

如前所述(Frampton等Nat.Biotechnol.31,1023-1031,2014),类似地对FoundationCORE中的所有样品进行处理和测序。在使用两种截然不同的方法在整个FoundationCORE数据集(n=58,707)中筛选 NRF2外显子2和外显子2+3缺失。

首先,检查基于不一致读段对和/或拆分读段的重排识别,以寻找NRF2外显子2或外显子2+3丢失的直接证据。虽然这种方法提供了目标缺失的直接证据,但如果断点位于诱饵区域内,则只能通过这种方法发现缺失,因为未捕获NRF2的内含子区域。因此,该方法鉴定了NRF2外显子2或外显子2+3缺失的有限子集,其中断点发生在内含子-外显子边界附近或外显子内。

第二方法利用来自各个诱饵区域的拷贝数对数比数据。使用针对每个样品的特定肿瘤细胞性进行训练的内部算法测定拷贝数对数比值。计算z评分,比较NRF2中与紧邻NRF2的对照多态性捕获区域 (n=15;从NRF2的上游~3MB和下游~12MB每隔~1MB均匀地间隔) 中的每个外显子的对数比。特别地检查具有和不具有同时发生的外显子3缺失的外显子2缺失。这些在本文中称为目标外显子(EOI)。如果(1)在NRF2中,对EOI,z评分<-2,但对于非EOI,z评分不小于 -2并且(2)计算NRF2中非EOI的对数比下降0.2,则识别EOI缺失。 NRF2外显子2或外显子2+3缺失与NRF2或KEAP1中的短变体之间的相互排斥性在肺鳞状细胞癌中被特异性地检查到(n=1,218)。

F.细胞培养

KMS-27(RPMI-1640)、JHH-6(Williams培养基E)、HuCCT1 (RPMI-1640)和HUH-1(DMEM)细胞来自JCRB,并且293(EMEM) 细胞来自ATCC。在2mM谷氨酰胺和10%FBS存在的情况下,在指定的培养基中培养细胞。

G.蛋白质印迹

用补充有完全无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)和phoSTOP (Roche)、磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma)和磷酸酶抑制剂混合物3 (Sigma)磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(Sigma)制备细胞裂解物。将裂解物在Novex Tris-甘氨酸4-12%梯度凝胶(ThermoFisher)上运行并转移到iBlot硝酸纤维素(Invitrogen)上。将印迹在TBST(10mM Tris pH8,150mM NaCl,0.1%TWEEN-20)中的5%脱脂奶粉(Merck)中预孵育,然后在含有抗体的TBST中的5%牛血清白蛋白(Sigma)中孵育。使用的二抗是ECL抗兔HRP和ECL抗小鼠HRP(均来自GE Heathcare)。用化学发光底物试剂盒(Protein Simple)使印迹显色,并用 FluorChem HD2成像仪(Protein Simple)进行显现。本研究中使用的抗体针对KEAP1(Cell Signaling G1010)、NRF2(Abcam ab62352)、HSP90 (Cell Signaling 4877)、HDAC2(Cell Signaling 5113)、β-肌动蛋白(Sigma A2228)、HA(Roche 11815016001)和FLAG(Sigma F2426)。λ磷酸酶来自NEB(P0753L),并且在这些实验中从裂解缓冲液中省略了磷酸酶抑制剂。

H.细胞活力和DNA片段化分析

用Dharmafect 2试剂(ThermoFisher)和OptiMEM(Gibco)将siRNA 逆转染到细胞中。转染后4天,使用CellTiter-Glo试剂(Promega)测量细胞的活力,并在EnVision多标签读数器(Perkin Elmer)上检测发光。用Dharmafect 2试剂(ThermoFisher)和OptiMEM(Gibco)将siRNA 逆转染到细胞中。转染后4天,使用碘化丙啶(PI)(Life Technologies) 染色和流式细胞术,按照公布的方案(Riccardi和Nicoletti Nat.Protoc. 1:1458-1461,2006)测量细胞的凋亡。在染色前24小时将星形孢菌素 (1μM)(Enzo)加入阳性对照细胞中。靶向NRF2外显子2的siRNA具有序列:5’-TGGAGTAAGTCGAGAAGTA-3’(SEQ ID NO:29)和 5’-ACAACTAGATGAAGAGACA-3’(SEQ ID NO:30)。靶向NRF2外显子5的siRNA具有序列:5’-TGACAGAAGTTGACAATTA-3’(SEQ ID NO:31)和5’-GTAAGAAGCCAGATGTTAA-3’(SEQ ID NO:32),并将其与非靶siRNA一起使用作为对照siRNA。用Becton Dickinson FACS Caliber仪器分析染色的细胞。靶向KEAP1的siRNA来自 Dhamacon(L012453-00)。

根据Riccardi等(Nature Protocols,1:1458-1461(2006)),通过碘化丙啶(PI)染色定量DNA片段化并通过流式细胞术测量。

I.Taqman分析

用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总细胞RNA。使用高容量cDNA 反转录试剂盒(Applied Biosystems)将RNA转化为cDNA,并使用 Taqman基因表达预混合试剂(Applied Biosystems)用Taqman基因表达引物-探针组(ThermoFisher)扩增cDNA。在QuantStudio7Flex实时 PCR系统上进行Taqman扩增/检测。使用的引物-探针组是 Hs00232352_ml和Hs00975961_g1以分别检测NRF2外显子2和5 (ThermoFisher)。使用的NRF2靶基因Taqman引物-探针组是: SLC7A11(Hs00921938_ml)、SGRN(Hs00921938_ml)、NR0B1 (Hs03043658_ml)、GCLC(HsOOI55249_ml)和GPX2 (Hs01591589_ml),均来自ThermoFisher。

J.293转染。

按照制造商的方案推荐,使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher) 和OptiMEM(Gibco)将质粒DNA转染到细胞中。转染后2-3天制备裂解物。使用的表达质粒是pRK5.NRF2、pRK5.NRF2.delta.e2、 pRK5.NRF2.delta.e2,3、pRK5.NRF2.FLAG和pRK5.KEAP1.HA。

K.肿瘤异种移植模型

将11至12周龄雌性C.B-17SCID.米色小鼠(Charles River Laboratories)在右侧腹侧皮下接种每小鼠10x106个A549shRNA细胞 (于100μl(BD Biosciences)中)或10x106个H441 shRNA细胞(于100μl HBSS中)。当肿瘤体积达到约150-250mm3时,使小鼠随机接受含有1mg/ml多西环素(于5%蔗糖中)或不含多西环素(仅5%蔗糖)的饮用水,随意获得饮用水。多西环素每周更换3次,并且每周更换一次蔗糖。使用数字卡尺(Fred V.Fowler Company, Inc.),使用公式(L x W x W)/2测定肿瘤体积,并将其绘制为平均肿瘤体积(mm3)+/-SEM。将肿瘤生长抑制(TGI%)计算为每日相应剂量组相对媒介物的拟合曲线下面积(AUC)的百分比,使得TGI%=100×1- (AUC治疗/天)/(AUC媒介物/天)。在分开的研究中,向具有150-250 mm3的肿瘤的小鼠施用1mg/ml多西环素,进行5天,然后切取肿瘤,并通过蛋白质印迹分析其NRF2水平。

L.用ErbB3抗体处理的A549异种移植物

在第1天通过静脉内施用,用媒介物或50mg/kg YW57.88.5(100 mg/kg负荷剂量)处理携带皮下A549肿瘤(75–144mm3)的雌性裸鼠(n =10),每周一次,持续4周(qwk x 4)。每周测量肿瘤两次,并且在其肿瘤达到1000mm3的体积的早期终点或在治疗方案的最后一天对每只动物实施安乐死。

实施例2:在KEAP1和NRF2中具有突变的NSCLC细胞系的鉴定

为了鉴定NSCLC中KEAP1和NRF2的突变、拷贝数和杂合性丢失(LOH),记录了通过RNA测序、外显子组测序或SNP阵列分析的113个NSCLC细胞系小组(图1A)。在29/113(26%)的细胞系中发现KEAP1突变,并且在4/113(4%)的细胞系中检测到NRF2突变。除NCI-H661细胞系外,所有KEAP1突变的细胞系均显示突变等位基因的纯合表达,其通常与拷贝中性LOH相关。相反,NRF2突变是杂合的并且与LOH无关。另外两种细胞系(HCC1534和NCI-HI437) 通过KEAP1DNA的双等位基因丢失显示没有可检测的KEAP1 mRNA。NRF2突变位于KEAP1界面区域中的先前鉴定的热点中(图 1B)(Shibata等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:13568-13573,2008),并且包括点突变和框内3-氨基酸缺失。KEAP1中的突变遍布整个一级序列(图1C),几乎没有明显的热点。然而,当作图至KEAP1/NRF2 肽晶体结构上时(Fukutomi等Mol.Cell.Biol.34:832-846,2014),环中的突变聚簇从KEAP1核心β螺旋推进区域延伸靠近与NRF2相互作用的位点(图1D)。

实施例3:突变型KEAP1基因标签的鉴定

为了确定KEAP1突变在NSCLC细胞系中的转录后果,鉴定了与野生型KEAP1细胞系相比在KEAP1突变型细胞系中显著地差异表达的基因(p<0.01,绝对平均倍数变化>2)。总体而言,KEAP1突变型细胞系中有27个基因被显著上调(图2A-2B),其中15个先前已被鉴定为来自ChIP-测序或RNA测序研究的NRF2靶基因(Chorley等 Nucleic Acids Res.4:7416-7429,2012;Hirotsu等Nucleic Acids Res. 40:10228-10239,2012;Malhotra等Nucleic Acids Res.38:5718-5734, 2010)。通过使用这些截断值,只有一种基因HSPB1被鉴定为被显著下调。

基于这27个基因的表达的230个TCGA肺腺癌的无监督聚类导致分成两个主要的组(图3A)。一个组的主要特征是27个标签基因的高表达,并包含43个肿瘤,其中32个(74%)是KEAP1突变体。另一组以低表达为特征,包含187个肿瘤,其中179个为KEAP1野生型。令人惊讶的是,通过使用相同的基因组来对肺鳞状细胞癌进行聚类, NRF2以及KEAP1突变型肿瘤可与NRF2/KEAP1野生型肿瘤区别开来(图3B),表明NRF2介导了大部分KEAP1丢失/突变的转录后果。有趣的是,有几个鳞状NSCLC肿瘤显示KEAP1突变型基因的高表达,而在KEAP1或NRF2中没有任何已知的突变。在KEAP1突变型细胞系中上调的27个基因当中,蛋白质组学数据可用于较小的细胞系亚组(37个野生型KEAP1,6个突变型KEAP1)中的17个细胞系。与突变型KEAP1细胞系中这些基因的mRNA水平升高一致,这17 个基因中除一个(SLC7A11,其具有低肽覆盖度)外的所有基因的蛋白质靶标也显示相对于野生型细胞系在突变型KEAP1细胞系中表达增加(图4)。

实施例4:肿瘤样品中NRF2的异常剪接的鉴定

对于大多数具有27个候选NRF2靶基因的高表达的肿瘤,可以通过KEAP1或NRF2中的突变来解释升高的基因表达。然而,存在一些在KEAP1或NRF2中缺乏表征的突变的情况下显示候选NRF2 靶基因的高表达的肿瘤。癌症相关的转录物改变越来越多地被认为是可能的驱动者事件(driver event)。因此,假设这些肿瘤中的NRF2途径激活可能是由不被全外显子组测序识别的剪接改变驱动的。分析了 54种已知的癌基因以鉴定在来自TCGA的癌症样品中被反复观察到、但在来自GTEx的正常样品中很少被检测到的剪接变体(参见实施例 1)。选择了19种癌症类型,每种类型包括至少100个癌症样品(总共 6,359个样品)。在54种被考虑的癌基因中,鉴定了9个复发的候选癌症特异性剪接变体(对于给定的癌症类型,≥2个样品和>1%的样品)。使用与癌症样品中相同的检测标准,在正常对照(总共2,958个样品)中均未检测到这些变体。将具有共有剪接位点的相关变体组合在一起,在四个癌基因中产生了五个独立的改变(图5)。这些改变包括几个良好记录的致癌剪接变体,包括脑癌中的EGFRvIII、肺腺癌中的MET外显子14跳跃和结肠直肠癌中的CTNNB1外显子3缺失 (Cho等Cancer Res.71(24):7587-7596,2011;Kong-Beltran等Cancer Res.66(1):283-289,2006;Iwao等Cancer Res.58(5):1021-1026,1998)。有趣的是,先前未表征的NRF2中的剪接变体在患有鳞状NSCLC (3.3%;16/481)的患者中频繁地被观察到和发生,并且在患有HNSC 的患者(1.5%;6/403)以较低的发生率被观察到和发生(图5A)。对肺鳞癌中NRF2剪接变体的更详细分析显示,在同一患者中同时存在两种剪接变体,对应于从两种可变启动子中的任一种转录的mRNA中的 NRF2外显子2的跳跃(2.1%;10/481)(图6)。在不同组的患者中(1.2%; 6/481)同时存在两种另外的剪接变体,对应于从两种可变转录起始中的任一种转录的mRNA中的NRF2外显子2和3两者(外显子2+3)的跳跃(图6)。表达缺乏外显子2或外显子2+3的NRF2剪接变体的所有患者也显示出如通过支持外显子2的包含的拆分读段所证明的正常NRF2转录物的表达。外显子2和3均为NRF2编码序列的一部分,并且预测外显子2或外显子2+3的跳跃导致具有N-末端截短或框内缺失的蛋白质同种型(图7)。缺乏外显子2的NRF2转录物的高复发和编码潜力的保持表明这些剪接变体可以呈现赋予选择性优势的功能获得事件。这得到了外显子2编码Neh2结构域的发现的支持,所述Neh2结构域允许与KEAP1相互作用(Itoh等Genes Dev.13(1):76-86, 1999),其在15%的鳞状肺癌中发生突变。

为了评估观察到的NRF2剪接变体是否可以解释没有KEAP1或 NRF2突变的患者中的NRF2途径激活,观察到NRF2剪接变体和 NRF2途径突变的共同发生。在TCGA集合中,通过外显子组测序对所述鳞状肺肿瘤中的178个进行了谱分析。在该亚组中,显示外显子 2或外显子2+3缺失的10个肿瘤(6%)与48个(27%)显示NRF2或 KEAP1中的突变的肿瘤相互排斥(图8A)。此外,所有外显子-2缺失的肿瘤显示出27个候选NRF2靶基因的高表达(图8B)。对头颈癌进行了类似的观察,其中5个(2%)肿瘤中的NRF2外显子缺失与26个 (9%)肿瘤中的NRF2或KEAP1中的突变相互排斥(图9A-9B)。这些结果表明,外显子2的缺失代表了在鳞状NSCLC和头颈肿瘤亚组中激活NRF2的替代机制。重要的是,这些结果表明,除了外显子组测序以外,还考虑了剪接改变,其使被鉴定为具有推定的NRF2途径激活的患者的百分比从27%(48/178)增加至33%(58/178)(在肺鳞癌中) 和从9%(26/275)增加至11%(31/275)(在头颈鳞癌中)。

实施例5:细胞系中NRF2剪接缺陷的验证

为了鉴定用于进一步研究的细胞系模型,从大的人癌细胞系小组中分析了RNA测序数据中鉴定的剪接变体的读段证据(在Klijn等 Nat.Biotechnol.33(3):306-312,2014中描述的)。在611个细胞系中,鉴定出一个多发性骨髓瘤细胞系KMS-27和一个肝细胞癌细胞系 JHH-6,两者均显示通过接合读段NRF2外显子2的杂合跳跃的证据 (图10)。JHH-6和KMS-27mRNA中通过RT-PCR显示的NRF2外显子2跳跃被验证。使用分别源自外显子1和外显子3/4的一系列正向和反向引物(图11A),证实了从JHH-6和KMS-27细胞分离的mRNA 中的外显子2缺失(Δe2NRF2)(图11B)。PCR产物的测序证实了预期的外显子2缺失(图12A-12C)。基于RNA测序数据,在JHH-6或 KMS-27中的NRF2或KEAP1的编码序列中未检测到点突变(Klijn等Nat.Biotechnol.33(3):306-312,2014)。

由于NRF2/KEAP1改变在肝细胞癌(10%)中相当常见,但在多发性骨髓瘤(0%)中不常见,因此进一步测试了JHH-6细胞。具体地,测试了NRF2蛋白的外显子2缺失形式的表达。对来自JHH-6细胞以及 KEAP1突变型HUH-1系和作为代表性野生型KEAP1肝癌细胞系的 HuCCT1细胞的全细胞裂解物进行蛋白质印迹。JHH-6细胞中NRF2 的水平与在HUH-1细胞中看到的水平相当,所述水平远高于野生型 KEAP1HuCCT1细胞中的水平(图13)。此外,在JHH-6中可检测到与外显子2缺失一致的较小分子量种类,并且其在NFE2L2 siRNA转染后减少,证实其确实代表NRF2的一种形式。虽然改变的NRF2同种型是可见的,但令人惊讶的是,由于缺乏KEAP1相互作用基序,其并不更丰富。假设外显子2缺失的NRF2的磷酸化形式可能与野生型NRF2的未磷酸化形式在所用的4-12%凝胶中共迁移。实际上, JHH-6裂解物的去磷酸化显示NRF2的外显子2缺失形式比野生型形式显著更丰富(图14A,中图)。类似地,KMS-27细胞表达NRF2的外显子2缺失形式,其是去磷酸化后明显的主要种类(图15)。

使用环己酰亚胺(以消除总蛋白质合成)测试NRF2在三种肝癌细胞系中的稳定性。使用去磷酸化的裂解物以允许更准确地定量总 NRF2。实验显示在JHH-6细胞中Δe2NRF2的稳定性增加,与HUH-1 细胞中的NRF2相当,两者均比HuCCT1细胞中的NRF2更稳定(图 14A-14B)。此外当与HUH-1细胞相比时,JHH-6细胞中NRF2的外显子2缺失形式还显示出显著的核定位(图16)。

为了确定JHH-6细胞中外显子2的缺失是否使得NRF2难以通过 KEAP1调控,测试了NRF2响应于KEAP1敲低的稳定性。由于稳定性增加,HuCCT1细胞中KEAP1的敲低导致NRF2的稳态水平增加(图 14C)。然而,JHH-6细胞中KEAP1的敲低不影响外显子2缺失的NRF2 的水平或稳定性。如所预期的,KEAP1的敲低不会增加KEAP1突变型HUH-1细胞系中野生型NRF2的稳定性(图14D)。

实施例6:对NRF2的外显子2和/或外显子2+3缺失的评估

使用实施例3中描述的NRF2/KEAP1基因标签,确定了在16个肝细胞癌细胞系当中,JHH-6细胞显示NRF2靶基因的最高表达(根据RNA测序数据),与在表达突变型KEAP1的细胞系中所见的那些类似(图17A)。类似地,在检查的18个多发性骨髓瘤细胞系中, KMS-27细胞显示这些基因的最高表达(图17B)。这些基因的表达可以通过“NRF2靶基因评分”来概括,该评分计算为所检查的611细胞系中各个靶基因的z-评分的平均值。这产生反映给定细胞系中标签基因的过表达程度的每细胞系的单个评分。NRF2靶标评分证实JHH-6 细胞显示与表达KEAP1突变的肝癌细胞系相似的评分(图18A),并且KMS-27细胞显示多发性骨髓瘤细胞系中的最高评分(图18B),尽管多发性骨髓瘤显示低的总NRF2靶基因评分(由负值表示的)。

接下来,将表达外显子2缺失的NRF2的JHH-6细胞对NRF2蛋白表达的依赖性与表达野生型NRF2的HuCCT1细胞进行比较。在 JHH-6细胞中敲低NRF2引起细胞活力的显著降低,类似于在突变型 KEAP1肝细胞癌细胞系HUH-1中观察到的。相反,NRF2敲低对 HuCCT1细胞的活力具有更加适度的影响(图19)。这不归因于 HuCCT1细胞中的缺陷型NRF2敲低,因为NRF2敲低在所有三种细胞系中同样有效(图20)。NRF2的敲低还导致四种充分表征的NRF2 靶基因的表达降低,尽管这在野生型KEAP1HuCCT1细胞系中略微降低(图21)。如通过片段化DNA的增加所测量的,降低的活力可能至少部分地由凋亡造成(图22)。

为了解决NRF2外显子2的丢失如何影响NRF2受KEAP1调控的能力,使用293细胞中的瞬时表达。KEAP1降低了全长NRF2的表达,但对缺乏外显子2或外显子2+3的NRF2的表达具有较小的影响(图23,上图)。正如预期的那样,KEAP1对全长NRF2表达的抑制作用大部分被蛋白酶体抑制剂MG132消除。全长NRF2和KEAP1 彼此相互作用,而外显子2或外显子2+3的缺失完全消除了KEAP1 结合NRF2的能力(图23,下图)。结果,与野生型NRF2相比,截短的NRF2在KEAP1表达后保持稳定(图24A-24B),尽管截短形式的 NRF2似乎具有略微降低的内在稳定性。然而,改变的NRF2同种型具有转录活性,这可通过它们增加NRF2靶基因表达的能力来判断(图 25)。与全长NRF2相比,外显子2-或外显子2+3-缺失的NRF2类似地使大多数基因增加,并且大多数基因对KEAP1过表达的作用具有抗性。有趣的是,外显子2+3缺失的NRF2在增加GPX2表达方面存在缺陷,这表明这种形式的NRF2的转录激活可能存在细微差异。与该观察结果一致,除了GPX2之外,实施例3中描述的27种靶基因中的22种与外显子2缺失的肿瘤相比在外显子2+3缺失的鳞状肺肿瘤中显示出较低的中值表达(图26)。

实施例7:NRF2外显子2剪接改变的机理分析

对KMS-27和JHH-6的外显子组测序数据的分析显示了作图至外显子2的读段的减少,这表明观察到的转录物变体可能是基因组改变的结果(图27A)。JHH-6和KMS-27的全基因组测序(WGS)显示这些细胞系具有围绕NRF2外显子2的微缺失,分别跨越4,685和2,981 个核苷酸(图27B)。为了研究患者的因果机制,分析了具有高读段覆盖度(>300x)的临床鳞状NSCLC肿瘤的大型群组(n=1,218)的靶向配对末端外显子组测序数据。在该数据集中,与附近的对照区域相比, 11个肿瘤显示外显子2或外显子2+3的拷贝数减少(材料和方法;图 27B)。通过研究靶向测序的确定的基因组区域的对数比,可以理解缺失的局部性质(图28B)。具有不一致读段对的七个肿瘤与包含数千碱基的DNA并影响外显子2或外显子2+3的结构变体一致(图28A)。总共有16名患者显示出影响NRF2外显子2或外显子2+3的基因组改变的证据,并且所鉴定的事件与NRF2和KEAP1中的点突变或插入缺失相互排斥,已知所述点突变或插入缺失可激活该途径。分析了另外一个群组的45个鳞状NSCLC肿瘤,其中RNA和DNA均可获得。RT-PCR分鉴定了具有外显子2丢失的患者,与邻近的正常组织相比所述外显子2丢失在肿瘤中强烈富集(图29)。RNA测序分析证实转录物变体在鉴定的肿瘤中表达,但在相邻的正常组织中不存在 (图30)。NRF2靶基因的表达也升高至与该途径中具有已知突变的 TCGA肿瘤中的所述表达相似的程度,而相邻的正常组织显示这些基因的低表达(图31)。最后,全基因组测序证实转录物变体是外显子2 周围5,233个核苷酸的体细胞基因组微缺失的结果(图28C)。这些数据表明基因组微缺失是NRF2途径激活的临床相关机制。

这些数据表明,由NRF2调控的一组基因在不同的组织和条件下是保守的。这在使用单个基因标签来鉴定NSCLC和HNSC中具有 NRF2激活的肿瘤方面具有实用价值(图32)。有趣的是,这种 NRF2/KEAP1标签仅在肿瘤中被激活。肺和头颈肿瘤的匹配正常样品仅显示低NRF2靶基因活性(图33)。这表明与正常组织相比,NRF2 途径的抑制可能在显示通路失调的肿瘤中具有选择性益处。

先前已经报道了许多基因(包括EGFR和CTNNB1)的导致原癌基因激活的基因内基因组缺失。部分归因于当前基因组技术的限制,此类变体不是常规测定的。特别是,仅通过外显子组测序难以检测到影响个体外显子并且涉及小拷贝数变化的小畸变。因此,基因内缺失仍然是相对未开发的,并且仍在发现新的变体。最近对小细胞肺癌和成人T细胞白血病/淋巴瘤的研究使用全基因组测序鉴定了TP73、IKZF2 和CARD11中的复发性微缺失(George等Nature 524,47-53:2015; Kataoka等Nat.Genet.47:1304-1315,2015)。在本研究中,作为TCGA 项目的一部分产生的公开可获得的RNA测序数据用于鉴定已知癌基因中的复发转录物改变。由于患者群组之间的差异,很难评估NRF2 外显子缺失的一般发生率。例如,当用可用的RNA测序数据分析 TCGA肺鳞癌(n=481)时,我们鉴定出3%(16/481)的具有NRF2外显子2或外显子2+3缺失的患者。当用可用的外显子组-测序数据分析可对其进行体细胞突变识别的患者的亚组(n=178)时,具有NRF2外显子缺失的患者的比例为6%(10/178)。NRF2外显子缺失的计数将具有推定NRF2途径激活的患者的百分比与仅通过外显子组测序评估 NRF2或KEAP1的突变相比,从27%(48/178)增加至33%(58/178)(在肺鳞癌中),以及从9%(26/275)增加至11%(31/275)(在头颈鳞状细胞癌中)(图8A和9A)。来自接受基因组谱分析的患者的真实临床样品的分析表明在1-2%的肺鳞状细胞癌中发生NRF2外显子缺失。然而,后一种分析缺乏灵敏度,因为尚未建立用于确定具有可变肿瘤含量的样品中单外显子缺失的优化标准,并且仅考虑明确的缺失。然而,本文提供的结果与在特定肿瘤适应症(诸如鳞状NSCLC和头颈癌)中经常改变该途径的调节的概念一致。还可以通过对完整基因座(包括内含子)的测序或通过组合来自外显子组和RNA测序实验的数据来进一步筛选已知的癌基因。

对由WGS鉴定的三个缺失的结构的分析显示断裂点是不同的,但在每种情况下,侧接有缺失的基因组区域显示具有序列同源性的 2-6个核苷酸(图34)。JHH-6细胞的3'末端、5'末端和接合读段的DNA 序列分别由SEQ ID NO:61-63提供。KMS-27细胞的3'末端、5'末端和接合读段的DNA序列分别由SEQ ID NO:64-66提供。原代肿瘤细胞的3'末端、5'末端和接合读段的DNA序列分别由SEQ ID NO:67-69 提供。

除点突变以外,NRF2通常还显示基因组扩增。有趣的是,虽然通过RT-PCR分析获得的KMS-27细胞中的NRF2缺失产物的强度似乎与野生型NRF2相似,但其在JHH-6细胞中似乎更丰富(图13)。这也反映在WGS读段计数中,这表明与野生型等位基因相比,缺失形式的丰度更高(图27B)。这些结果与JHH-6细胞携带5个拷贝的NRF2 基因基因座(通过SNP测定检测的)而KMS-27细胞携带2个拷贝的观察结果一致。在所分析的TCGA样品中NRF2的扩增相当频繁,包括鳞状(4.5%)和腺瘤(2.6%)NSCLC、HNSC(12.2%)和肝癌(3.6%),并且代表增加NRF2转录输出的机制。在JHH-6细胞的情况下,这些数据表明缺失的等位基因已被优先扩增,提供了增强该细胞系中的NRF2 信号传导的另外机制。然而,在原发性肿瘤中未观察到截短的/剪接的等位基因的优先扩增,表明单独的外显子2或2+3缺失可为克隆选择提供足够的NRF2活性。

外显子2的缺失提供了一种优雅的机制,通过除去与KEAP1的相互作用位点来增加NRF2活性,同时使基因的其余部分在DNA结合和转录激活功能上保持功能完整。实际上,我们的生化分析证实,当缺失外显子2时,KEAP1结合几乎完全丧失并导致NRF2的稳定化(图23和24)。当考虑在肿瘤中发现的NRF2点突变时,围绕ETGE 高亲和力结合位点的突变导致KEAP1相互作用的完全丧失,而较低亲和力DLG基序中的突变在其破坏NRF2/KEAP1复合物的能力方面不同(Fukutomi等Mol Cell Biol.34(5):832-846,2014;Shibata等Proc. Natl.Acad.Sci.USA.105(36):13568-13573,2008)。然而,即使不破坏复合物的点突变也会改变相互作用的性质,诸如阻止KEAP1介导的 NRF2泛素化(Shibata等Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 105(36):13568-13573,2008)。虽然在缺失外显子2和3的情况下与 KEAP1的相互作用类似地被消除,但外显子3含有Neh4结构域,该结构域先前参与通过与CREB(cAMP应答元件结合蛋白)结合蛋白 (CBP)结合而被NRF2转录激活(Katoh等Genes Cells.6(10):857-868, 2001)。Neh4(包含在外显子3中)和Neh5(包含在外显子4中)显示出在募集CBP中协同作用。与此一致,观察到与Δe2NRF2或NRF2 中的肿瘤相关点突变相比,Δe2+3NRF2诱导一些NRF2靶基因的能力降低(图25和26)。

在其它基因中也已观察到在人肿瘤中发现的去除与E3连接酶的相互作用的结构域的缺失。例如,222个结直肠肿瘤中的7个显示围绕β-连环蛋白的外显子3的小基因组缺失(234-677bp)(Iwao等Cancer Res.58(5):1021-1026,1998)去除了其E3连接酶β-TRCP的相互作用位点(Hart等Curr.Biol.9(4):207-210,1999)。类似地,在前列腺癌中发现的大多数TMPRSS-ERG融合蛋白编码ERG的截短形式,这使得它们对泛素化和降解(由SPOP介导)具有抗性(An等Mol.Cell. 59(6):904-916,2015)。

另外,导致MET外显子14跳跃的突变去除了氨基酸残基Y1003,所述氨基酸残基是Cbl募集和随后泛素化和下调所需的。因此,小的基因内缺失代表了新生癌基因在肿瘤起始和进化过程中逃避正常降解的有效机制。

实施例8:突变型KEAP1细胞中的NRF2敲低

该实施例提供了KEAP1突变对不同生长环境下NRF2活性需求的影响的表征,并且表明NRF2活性对于非贴壁依赖性条件下的生长是必需的。

检测了NRF2抑制对野生型以及突变型KEAP1和NRF2细胞系的结果。建立了在多西环素控制下表达三种独立的NRF2 shRNA的稳定细胞系,以及三种独立的非靶向对照(NTC)。这些NRF2 shRNA 在五种KEAP1突变细胞系、两种NRF2突变型细胞系和五种野生型 NSCLC细胞系中以及永生化但未转化的肺上皮细胞BEAS2B细胞中有效降低NRF2蛋白水平(图35)。加入多西环素后,大多数细胞系的活力降低至不同程度,其中KEAP1突变型细胞系通常表现出显著更大的降低(图36和37)。在较大的一小组NSCLC细胞系中通过siRNA 敲低NRF2证实了对细胞活力的基因型依赖性作用(图38)。

表征了肿瘤异种移植物中NRF2敲低的结果。将表达dox诱导型 NRF2 shRNA的KEAP1突变型A549细胞系和KEAP1野生型H441 细胞系植入雌性SCID小鼠的侧腹。在两种肿瘤中,在多西环素处理的小鼠中NRF2被有效地敲低(图39和40)。KEAP1突变型A549细胞系中的NRF2敲低对肿瘤生长具有显著影响,导致在10个肿瘤中的5个中完全肿瘤消退(图41A)。相反,对KEAP1野生型H441生长的影响更为温和,导致肿瘤生长减少37%,所有动物均显示出维持的肿瘤负荷(图41B)。

为了理解NRF2敲低对异种移植物肿瘤扩增与塑料上的2D生长之间的差异作用,测试了几种额外的细胞培养环境。在低粘附板和/ 或低氧(0.5%)中生长的细胞中的NRF2敲低显示出与在塑料上生长的细胞类似的后果(图42)。相反,当在软琼脂(图43和44)中、微图案化塑料薄膜(图45和46)上或甲基纤维素(图47)中培养时,KEAP1突变型细胞系的生长受到严重损害。软琼脂中的生长用于更详细地表征 NRF2敲低的后果。虽然NRF2的敲低完全消除了三种KEAP1突变型细胞系中的集落形成,但其在H1048和H441(两种野生型KEAP1 NSCLC细胞系)中几乎没有影响(图43和44)。评估了谷胱甘肽途径响应于NRF2敲低的作用,因为已经显示该途径介导由高NRF2活性促进的存活性质。虽然添加还原型谷胱甘肽通常会增加所有测试细胞系在软琼脂中形成集落的能力,但其无法挽救NRF2敲低的后果(图 43和44)。用N-乙酰基半胱氨酸(NAC;图48)观察到类似的阴性结果。如通过测量二氯荧光素染色所测量的,外源性谷胱甘肽能够进入细胞并降低活性氧(ROS)水平(图49)。因此,对NRF2活性的要求令人惊讶地独立于谷胱甘肽合成途径。

为了进一步探索谷胱甘肽途径在NRF2响应中的作用,监测了 xCT谷胱甘肽/半胱氨酸逆向转运蛋白的表达和活性(谷胱甘肽合成中的限速步骤之一)。NRF2敲低后SLC7A11表达降低(图50),导致与还原型谷胱甘肽相关(图52)的胱氨酸摄取减少(图51)。NRF2敲低也导致ROS水平大幅增加(图53)。为了确定抑制SLC7A11表达和胱氨酸摄取是否有助于降低NRF2敲低后的活力,使用埃拉汀(erastin)启动xCT功能,这抑制胱氨酸摄取(图51)和增加了氧化应激(图53)。然而,这不足以降低KEAP1突变型细胞系A549(图54)或大多数其它 KEAP1突变型细胞系(图55)的活力。然而,埃拉汀和NRF2敲低的组合确实导致活力的显著降低(图54)。类似地,谷胱甘肽合酶抑制剂丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)或谷氨酰胺酶抑制剂BPTES也未显示出对 KEAP1突变型细胞系的优先毒性(图56和57)。这些结果表明补充谷胱甘肽不足以挽救NRF2敲低诱导的致死率,谷胱甘肽的耗尽也不足以杀死KEAP1突变型细胞系。

为了了解哪些途径由于NRF2激活或KEAP1丢失而被激活,使用基因库进行CRISPR筛选,所述基因库在A549细胞中于NRF2敲低后降低和/或在一小组KEAP1突变型NSCLC细胞系中升高。由于在于2D、3D和异种移植物生长条件下进行NRF2敲低后观察到明显的后果,在所有三种环境下进行筛选以确定是否可以鉴定离散的依赖性。对于所有三个条件在15-天的时间点,所有三个筛选表现相似,其中gRNA仅代表少量显示显著退出的基因(图58-60)。NFE2L2及其结合伴侣MAFG,是最重要的基因之一,表明筛选按预期进行。磷酸戊糖途径基因PGD、G6PD和TKT(已知的NRF2靶基因)也显示出强烈的退出。该筛选中的其它强命中是两个生长因子受体基因IGF1R 和ERBB3,以及编码氧化还原信号传导传递的三个组成部分的基因 PRDX1、TXN和TXNRD1。

在A549细胞中进行NRF2敲低后ErbB3的表达降低(图58-60)。在肿瘤异种移植模型中利用YW57.88.5的处理表明ErbB3是A549增殖所需的(图61)。

相对于KEAP1野生型NSCLC细胞系,KEAP1突变型NSCLC 细胞中IGF1R的表达更高。为了测试IGF1R抑制对KEAP1突变型和 KEAP1野生型细胞的影响,用林西替尼(一种高效且选择性IGF1R小分子抑制剂)处理细胞系。当在三种野生型和三种突变型KEAP1 NSCLC细胞系中测试时,林西替尼对增殖几乎没有影响。然而,该化合物在抑制A549细胞在软琼脂中的集落生长方面非常有效,具有约20nM的IC50。此外,当针对大的NSCLC细胞系小组进行测试时,在KEAP1突变型细胞系中该化合物的软琼脂中似乎存在选择性生长抑制。当在非贴壁依赖性条件下生长时,对于独立的IGF1R抑制剂 NVP-AEW541也观察到对KEAP1突变型细胞系的类似选择性作用 (图62)。

因此,通过IGF1R和ErbB3进行信号传导的生长因子是KEAP1 突变型细胞生长的重要介质。

其它实施方案

尽管上述本发明已出于清楚理解的目的通过说明和实施例的方式进行了详细描述,但描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容皆以全文引用的方式明确并入本文。

序列表

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gguccuggau gaggccacug cugcggugga ucuagagaca gacaaccuca uucagacgac 4680

cauccaaaac gaguucgccc acugcacagu gaucaccauc gcccacaggc ugcacaccau 4740

cauggacagu gacaagguaa ugguccuaga caacgggaag auuauagagu gcggcagccc 4800

ugaagaacug cuacaaaucc cuggacccuu uuacuuuaug gcuaaggaag cuggcauuga 4860

gaaugugaac agcacaaaau ucuagcagaa ggccccaugg guuagaaaag gacuauaaga 4920

auaauuucuu auuuaauuuu auuuuuuaua aaauacagaa uacauacaaa aguguguaua 4980

aaauguacgu uuuaaaaaag gauaagugaa cacccaugaa ccuacuaccc agguuaagaa 5040

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cuuucauuuc uguuuuauca ccuuuguaug uaucuuuaaa caacauauac ccuuuuuuac 5220

uuauguaaau ggacugacuc auacugcaua caucuucuau gacuugauuc uuuuguucaa 5280

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<210> 2

<211> 1610

<212> RNA

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acaguagcuc acaccuguaa ucccagcacu uuggaaggcc gaggugggcg gaucaccuga 60

gcucaggagu uugagaccag ccugucucua cuaacaauau aaaaauuagc ugggagucac 120

ggugggcgcc uguaauccca gcuacucggg aggcugaggc aggagaauug cuugaaccca 180

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caagacuguc ucaaaaacag caacagagag caggacguga gacuucuacc ugcucacuca 300

gaaucauuuc ugcaccaacc auggccacgu uuguggagcu caguaccaaa gccaagaugc 360

ccauuguggg ccugggcacu uggaagucuc cucuuggcaa agugaaagaa gcagugaagg 420

uggccauuga ugcaggauau cggcacauug acugugccua ugucuaucag aaugaacaug 480

aaguggggga agccauccaa gagaagaucc aagagaaggc ugugaagcgg gaggaccugu 540

ucaucgucag caaguugugg cccacuuucu uugagagacc ccuugugagg aaagccuuug 600

agaagacccu caaggaccug aagcugagcu aucuggacgu cuaucuuauu cacuggccac 660

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cuggacugaa auauaaacca gugacuaacc agguugagug ucacccauac cucacacagg 900

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gcucuccgga uagaccuugg gccaagccag aagacccuuc ccugcuggag gaucccaaga 1020

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uucaggucuu ugacuuuaaa uugagugaug aggagauggc aaccauacuc agcuucaaca 1200

gaaacuggag ggccuguaac guguugcaau ccucucauuu ggaagacuau cccuucaaug 1260

cagaauauug agguugaauc uccuggugag auuauacagg agauucucuu ucuucgcuga 1320

agugugacua ccuccacuca ugucccauuu uagccaagcu uauuuaagau cacagugaac 1380

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<210> 3

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uccgggcuuc cccagacaga cagcuggcuu acagggccac cugaagacgu uccagggcuc 60

cacaggccac ugucuucugg aggggaacgg aucgacugcc ggugcgccca gccaaauuca 120

acuccugagu ccucagucuc uagucccggg aagguuucac cgagcugccc uacuccuugu 180

accccuucua gcuggccuua gcauagcuac gucagcagcu auuggcacga cugcccugau 240

ucaaggagaa acuggacuaa uaucacuauc ucaacaggau cgaggccauc aagcuacaga 300

uggucuuaca aauggaaccc caagugaacu caacuaacaa cuuccaccaa ggaccccugg 360

accaacccgu uggcccuuug acuggccuaa agaguucccu ucugaaggac acuacaagug 420

cagggccccu ucuucgcccc uauccagcau cucuucucgg caaagugaaa gaagcgguga 480

agguggccau ugaugcagaa uaucgccaca uugacugugc cuauuucuau gagaaucaac 540

augagguggg agaagccauc caagagaaga uccaagagaa ggcugugaug cgggaggacc 600

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uugagaagac ccucaaggac cugaagcuga gcuaucugga cgucuaucuu auucacuggc 720

cacagggauu caagacuggg gaugacuuuu uccccaaaga ugauaaaggu aauaugauca 780

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ucaacuagga uaagaauauc acagaaaagc auggccugaa uaagcaaaug acaauuuuuu 1560

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guaagaaacg guugaacugg augcaauuuu uaucacagcu uguguaagac ugccucuguc 60

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uggauucgaa auaccagugu gugaagcuga augaugguca cuucaugccu guccugggau 240

uuggcaccua ugcgccugca gagguuccua aaaguaaagc ucuagaggcc gucaaauugg 300

caauagaagc cggguuccac cauauugauu cugcacaugu uuacaauaau gaggagcagg 360

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ggucacugaa aaaucuucaa uuggacuaug uugaccucua ucuuauucau uuuccagugu 540

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gacauauucu acacuucaaa gcuuuggucc acuuuucauc gaccagaguu gguccgacca 360

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ugaauccuac uucucuaaug cacaccuaca agagaagaga guacagcaac cucaaagccu 660

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ccaaaagaug aaaauggaaa aguaauauuc gacacagugg aucucucugc cacaugggag 480

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cuuugaguga ccgucccacc gugaagugaa uucucugagc ugguggugug gugcuggaag 3120

gaagguuauu uuuggagcca cucucucccc uuaaggauau uucccaaggg ccugcuucaa 3180

uucuuugaug acuuuagagg ugaaaaaaua uuuuuaugga gaugaugcag aaaacuccaa 3240

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auuauuaacu acauucgcca ugcuguaugu uagaucccca gaacauauuu auccugcaua 6240

ucuaaaauuu ugaucauuuu acaaacuuuc uauuuuuuuu gucaauuuuc uccagcuaga 6300

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<212> RNA

<213> 智人

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cauuaugcua uugagucaca acuacaacuu cacggacuua acauugaaga aaguaugcgg 780

augauaaagc caagagaggg ggaagaaacc uuaagaauag aggauauccu ugaaguaauu 840

gagaaggaag gagacucaau ugcagugauc cuguucagug gggugcauuu uuacacugga 900

cagcacuuua auauuccugc caucacaaaa gcuggacaag cgaaggguug uuauguuggc 960

uuugaucuag cacaugcagu uggaaauguu gaacucuacu uacaugacug gggaguugau 1020

uuugccugcu gguguuccua caaguauuua aaugcaggag caggaggaau ugcuggugcc 1080

uucauucaug aaaagcaugc ccauacgauu aaaccugcau uagugggaug guuuggccau 1140

gaacucagca ccagauuuaa gauggauaac aaacugcagu uaaucccugg ggucugugga 1200

uuccgaauuu caaauccucc cauuuuguug gucuguuccu ugcaugcuag uuuagagauc 1260

uuuaagcaag cgacaaugaa ggcauugcgg aaaaaaucug uuuugcuaac uggcuaucug 1320

gaauaccuga ucaagcauaa cuauggcaaa gauaaagcag caaccaagaa accaguugug 1380

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guuccaaaca aagauguuuu ccaagaacua gaaaaaagag gagugguuug ugacaagcgg 1500

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aaauuuacca aucugcucac uucuauacuu gacucugcag aaacaaaaaa uuagcagugu 1620

uuucuagaac aacuuaagca aauuauacug aaagcugcug ugguuauuuc aguauuauuc 1680

gauuuuuaau uauugaaagu augucaccau ugaccacaug uaacuaacaa uaaauaauau 1740

accuuacaga aaaucugaaa aaaaaaaaaa aaaa 1774

<210> 14

<211> 3519

<212> RNA

<213> 智人

<400> 14

cucacacgcc ggcucggaug aucuccugcc augacucagc gcuucucgca ggcugcccug 60

cuggggacac cggcuucgcu cgggccccuc ccgacgcguc cacccccucu cgccacccac 120

gcccgccccc agccgcuggg ccuuucccag ugcggccgcc gccgccacag cugcagucag 180

caccgucacc ccagcagcau ccgccgccug caccgcgcgu gcggcccgcc ccggccugac 240

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ggaagagaga cagcaauuga acauucaugg auuguugcca ccuuccuuca acagucagga 420

gauccagguu cuuagaguag uaaaaaauuu cgagcaucug aacucugacu uugacaggua 480

ucuucucuua auggaucucc aagauagaaa ugaaaaacuc uuuuauagag ugcugacauc 540

ugacauugag aaauucaugc cuauuguuua uacucccacu gugggucugg cuugccaaca 600

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uauugcuuca guucucaaug cauggccaga agaugucauc aaggccauug uggugacuga 720

uggagagcgu auucuuggcu ugggagaccu uggcuguaau ggaaugggca ucccuguggg 780

uaaauuggcu cuauauacag cuugcggagg gaugaauccu caagaauguc ugccugucau 840

ucuggaugug ggaaccgaaa augaggaguu acuuaaagau ccacucuaca uuggacuacg 900

gcagagaaga guaagagguu cugaauauga ugauuuuuug gacgaauuca uggaggcagu 960

uucuuccaag uauggcauga auugccuuau ucaguuugaa gauuuugcca augugaaugc 1020

auuucgucuc cugaacaagu aucgaaacca guauugcaca uucaaugaug auauucaagg 1080

aacagcaucu guugcaguug caggucuccu ugcagcucuu cgaauaacca agaacaaacu 1140

gucugaucaa acaauacuau uccaaggagc uggagaggcu gcccuaggga uugcacaccu 1200

gauugugaug gccuuggaaa aagaagguuu accaaaagag aaagccauca aaaagauaug 1260

gcugguugau ucaaaaggau uaauaguuaa gggacgugcu uccuuaacac aagagaaaga 1320

gaaguuugcc caugaacaug aagaaaugaa gaaccuagaa gccauuguuc aagaaauaaa 1380

accaacugcc cucauaggag uugcugcaau ugguggugca uucucagaac aaauucucaa 1440

agauauggcu gccuucaaug aacggccuau uauuuuugcu uugaguaauc caacuagcaa 1500

agcagaaugu ucugcagagc agugcuacaa aauaaccaag ggacgugcaa uuuuugccag 1560

uggcaguccu uuugauccag ucacucuucc aaauggacag acccuauauc cuggccaagg 1620

caacaauucc uauguguucc cuggaguugc ucuugguguu guggcgugug gauugaggca 1680

gaucacagau aauauuuucc ucacuacugc ugagguuaua gcucagcaag ugucagauaa 1740

acacuuggaa gagggucggc uuuauccucc uuugaauacc auuagagaug uuucucugaa 1800

aauugcagaa aagauuguga aagaugcaua ccaagaaaag acagccacag uuuauccuga 1860

accgcaaaac aaagaagcau uuguccgcuc ccagauguau aguacugauu augaccagau 1920

ucuaccugau uguuauucuu ggccugaaga ggugcagaaa auacagacca aaguugacca 1980

guaggauaau agcaaacauu ucuaacucua uuaaugaggu cuuuaaaccu uucauaauuu 2040

uuaaagguug gaaucuuuua uaaugauuca uaagacacuu agauuaagau uuuacuuuaa 2100

cagucuaaaa auugauagaa gaauaucgau auaaauuggg auaaacauca caugagacaa 2160

uuuugcuuca cuuugccuuc ugguuauuua ugguuucugu cugaauuauu cugccuacgu 2220

ucucuuuaaa agcuguugua cguacuacgg agaaacucau cauuuuuaua caggacacua 2280

augggaagac caaaauuacu aauaaauuga cauaaccaac auuaaaacuc auaauuauuu 2340

uguugaccau uuuguuaaaa ucuacuuuuc aaaaaaaaaa agcuagaaau gaaucuaggc 2400

guaggugaac uuuugcuaag cagaaauaac acuacuuugu ugccuagaga aagauaacuu 2460

cucaaguauu uuuauuccag uccuagauca uauauguucu uuugugcaac ggaauucuaa 2520

caguucuaag agaaagauca cugcuguuua cagcgccuug ugcagccuua gauuuuaaua 2580

uucuuuuguc auuguuacau cucauagagu aaagcucuua uuaccuugau ccugagucag 2640

aaaucccacc ugaaaucacc uuuuuucccc cuugaucaaa caucccaucc uucagcuacc 2700

auacuguugc uacagggauu uuguggacug uggccccugu cccgagguug gcaccuucag 2760

uucagcacag ccugagcagu gagaaggucu gaaaggagag uauauaguua agauccuuga 2820

gaaagggcug ccugaggaac ugaccucuua aagaucucag gaucuuuaag acaacaaguu 2880

agguuccuac uggaguuacc ugccagaaug gccucuuaau uaacucaggu aaugaagagc 2940

uaacuguguu auaaucaucu ugcuuuugcc ugaauuugga gaaaguauua uaauuaaguu 3000

cccaguauca gaaauguccu uacauaagau uaaaauaucu ugaugacuaa uaccauucua 3060

ugagaaagag uaguuauaug cccagacugu auuaauuuac uuuagaaacu aauguuugaa 3120

guaauggaaa aaauuuuaaa uuauaaagcu aaggugcaau aacauuugcu acuuauuuau 3180

agaauuauuu gaagaauuuu guuuuugaag uaaugcuuua aggaguauaa gauauucaag 3240

auaaauuaua cuauaaaaug auuuuauuga aaguugaagg uuacacaaau uguuuuaggu 3300

augagcagaa gagguuaagg uauuucuaaa gguaacauau agucaagagu uuccucaaaa 3360

uaguuauuug gagaagaauc agaaugucug uguauuucuu gucuguuucu auguugucuu 3420

auagcucuga cuaaaugugu uuaccuaugc aaaagauuua uuaaagcaua gaaaagguga 3480

augaauaaaa auauaaaaua auuguccuuu uucuuaaaa 3519

<210> 15

<211> 2917

<212> RNA

<213> 智人

<400> 15

ggcccuuccg gggcugcgcg gcucccccgc cucggugccg gcaaaaaugu gccuagucac 60

ggggccgcuc ucgggggaac ugaggucgcc uucgggcugg gacccggagc cccuucgccg 120

cgccccaaga ccuccuugag ugcgggcugc gacgcgcuca ccccgcuggg ccgucugugg 180

gcgcggcuuu gcgaagucau ccaucucucg gaucacucuc uggcagccuu gagcucucuu 240

gaaagcccag ccccgggacg agggaggagc gccuuaagug cccagcgggc ucagaagccc 300

cgacgugugg cggcugagcc gggccccgcg cacuuucucg gccggggagg gguucgggcu 360

cgggcacccg gaguuggccc cucguaacgc cgcgggaaag ugcgggcgag ggcaguggac 420

ucugaggccg gagucggcgg cacccggggc uucuaguucg gacgcggugc ccccuggugg 480

cgcucaccgc gcgcguggcc uuggcuuccg ugacagcgcu cgguuggccg ucacagcagc 540

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ggauuuagcg uuucagaauu gcaauuccaa aauguguaag acgggauauu cucuucugug 720

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ugaugacugc augcagcuuu uggcgcagac auucccguuu guagaugaca augagguuuc 1020

uucggcuacg uuucagucac uuguuccuga uauucccggu cacaucgaga gcccagucuu 1080

cauugcuacu aaucaggcuc agucaccuga aacuucuguu gcucagguag ccccuguuga 1140

uuuagacggu augcaacagg acauugagca aguuugggag gagcuauuau ccauuccuga 1200

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aaaagaagua gguaacugua guccacauuu ucuuaaugcu uuugaggauu ccuucagcag 1380

cauccucucc acagaagacc ccaaccaguu gacagugaac ucauuaaauu cagaugccac 1440

agucaacaca gauuuuggug augaauuuua uucugcuuuc auagcugagc ccaguaucag 1500

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cauugauguu ucugaucuau cacuuugcaa agcuuucaac caaaaccacc cugaaagcac 1620

agcagaauuc aaugauucug acuccggcau uucacuaaac acaaguccca guguggcauc 1680

accagaacac ucaguggaau cuuccagcua uggagacaca cuacuuggcc ucagugauuc 1740

ugaaguggaa gagcuagaua gugccccugg aagugucaaa cagaaugguc cuaaaacacc 1800

aguacauucu ucuggggaua ugguacaacc cuugucacca ucucaggggc agagcacuca 1860

cgugcaugau gcccaaugug agaacacacc agagaaagaa uugccuguaa guccugguca 1920

ucggaaaacc ccauucacaa aagacaaaca uucaagccgc uuggaggcuc aucucacaag 1980

agaugaacuu agggcaaaag cucuccauau cccauucccu guagaaaaaa ucauuaaccu 2040

cccuguuguu gacuucaacg aaaugauguc caaagagcag uucaaugaag cucaacuugc 2100

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aagaaaacug gaaaauauag uagaacuaga gcaagauuua gaucauuuga aagaugaaaa 2220

agaaaaauug cucaaagaaa aaggagaaaa ugacaaaagc cuucaccuac ugaaaaaaca 2280

acucagcacc uuauaucucg aaguuuucag caugcuacgu gaugaagaug gaaaaccuua 2340

uucuccuagu gaauacuccc ugcagcaaac aagagauggc aauguuuucc uuguucccaa 2400

aaguaagaag ccagauguua agaaaaacua gauuuaggag gauuugaccu uuucugagcu 2460

aguuuuuuug uacuauuaua cuaaaagcuc cuacugugau gugaaaugcu cauacuuuau 2520

aaguaauucu augcaaaauc auagccaaaa cuaguauaga aaauaauacg aaacuuuaaa 2580

aagcauugga gugucaguau guugaaucag uaguuucacu uuaacuguaa acaauuucuu 2640

aggacaccau uugggcuagu uucuguguaa guguaaauac uacaaaaacu uauuuauacu 2700

guucuuaugu cauuuguuau auucauagau uuauaugaug auaugacauc uggcuaaaaa 2760

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caugaacuuc aaucccauca uuuccagaaa ggacaucaca gguaaacuga aggacccugc 420

gaacuuucag uauccugccg agucuguucu ggcuuauaaa gaaggccauc ugagcccaga 480

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ucugcauuuc uguggcuucc aagucuuaga accucaacug acauauagca uugggcacac 600

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ggaugagaca ccacuguauu uugcuccaag cagccucuuu gaccuaaacu uccaggcagg 720

auucuuaaug aaaaaagagg uacaggauga ggagaaaaac aagaaauuug gccuuucugu 780

gggccaucac uugggcaagu ccaucccaac ugacaaccag aucaaagcua gaaaaugaga 840

uuccuuagcc uggauuuccu ucuaacaugu uaucaaaucu ggguaucuuu ccaggcuucc 900

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ggaaucgacu guauucgugc auuuuuggau cauuuuuaac ugauucuuau gauuacuauc 1020

auggcauaua accaaaaucc gacugggcuc aagaggccac uuagggaaag auguagaaag 1080

augcuagaaa aauguucuuu aaaggcaucu acacaauuua auuccucuuu uuagggcuaa 1140

aguuuuaggg uacaguuugg cuagguauca uucaacucuc caauguucua uuaaucaccu 1200

cucuguaguu uauggcagaa gggaauugcu cagagaagga aaagacugaa ucuaccugcc 1260

cuaagggacu uaacuuguuu gguaguuagc caucuaaugc uuguuuauga uauuucuugc 1320

uuucaauuac aaagcaguua cuaauaugcc uagcacaagu accacucuug gucagcuuuu 1380

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ugcagucauc uacuuuuuuu uuaauuaaaa aaaauuuuuu uuugaagcag ucuugcucug 1500

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guuauuuucu uuaucauugc uaaacugaug acuuacuaug ggaugggguc cagucccaug 1980

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gagaauauga uaaaacacug cccucuugug gugcauugaa agaagagaug agaaaugaug 2160

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accgagcugg aaaaccuccu uuaccagaug cugacuggca cuggugguuu uugcucucga 2280

caguauccac aauagcugac ggcugggugu uucaguuuga aaauauuuug uugccuucau 2340

cuucacugca auuuugugua aauuucucaa agaucugaau uaaauaaaua aaauucauuu 2400

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gaucagugcu ggggcuguuc gugcggcgau gagcccgggg ugggcagaga ggggcugcug 180

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cugagauuca ucaaugccaa ugucauugcu gaacuguucu ucaggcccau caucggcaca 1380

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gaagcgaaga ggucuucgca acagccgggc cacugccggg gacaucgccc acuacuacag 720

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uuuggggguc gagaucuccc ucguucucuc cgacgccucc cacccugggg gucgccugag 120

cucacuuggg gcucugugac ccuggcccua cggcgucucg ggcccagagc uccuucccug 180

cgggcccggc ccccugcccu cucggccgcg cagagcugac aucgcgcuga ucggauuggc 240

cgucaugggc cagaacuuaa uucugaacau gaaugaccac ggcuuugugg ucugugcuuu 300

uaauaggacu gucuccaaag uugaugauuu cuuggccaau gaggcaaagg gaaccaaagu 360

ggugggugcc cagucccuga aagagauggu cuccaagcug aagaagcccc ggcggaucau 420

ccuccuggug aaggcugggc aagcugugga ugauuucauc gagaaauugg uaccauuguu 480

ggauacuggu gacaucauca uugacggagg aaauucugaa uauagggaca ccacaagacg 540

gugccgagac cucaaggcca agggaauuuu auuugugggg agcggaguca gugguggaga 600

ggaaggggcc cgguauggcc caucgcucau gccaggaggg aacaaagaag cguggcccca 660

caucaagacc aucuuccaag gcauugcugc aaaaguggga acuggagaac ccugcuguga 720

cuggguggga gaugagggag caggccacuu cgugaagaug gugcacaacg ggauagagua 780

uggggacaug cagcugaucu gugaggcaua ccaccugaug aaagacgugc ugggcauggc 840

gcaggacgag auggcccagg ccuuugagga uuggaauaag acagagcuag acucauuccu 900

gauugaaauc acagccaaua uucucaaguu ccaagacacc gauggcaaac accugcugcc 960

aaagaucagg gacagcgcgg ggcagaaggg cacagggaag uggaccgcca ucuccgcccu 1020

ggaauacggc guacccguca cccucauugg agaagcuguc uuugcucggu gcuuaucauc 1080

ucugaaggau gagagaauuc aagcuagcaa aaagcugaag gguccccaga aguuccaguu 1140

ugauggugau aagaaaucau uccuggagga cauucggaag gcacucuacg cuuccaagau 1200

caucucuuac gcucaaggcu uuaugcugcu aaggcaggca gccaccgagu uuggcuggac 1260

ucucaauuau gguggcaucg cccugaugug gagagggggc ugcaucauua gaaguguauu 1320

ccuaggaaag auaaaggaug cauuugaucg aaacccggaa cuucagaacc uccuacugga 1380

cgacuucuuu aagucagcug uugaaaacug ccaggacucc uggcggcggg cagucagcac 1440

ugggguccag gcuggcauuc ccaugcccug uuuuaccacu gcccucuccu ucuaugacgg 1500

guacagacau gagaugcuuc cagccagccu cauccaggcu cagcgggauu acuucggggc 1560

ucacaccuau gaacucuugg ccaaaccagg gcaguuuauc cacaccaacu ggacaggcca 1620

ugguggcacc gugucauccu cgucauacaa ugccugauca ugcugcuccu gucacccucc 1680

acgauuccac agaccaggac auuccaugug ccucauggca cugccaccug gcccuuugcc 1740

cuauuuucug uucaguuuuu uaaaaguguu guaagagacu ccugaggaag acacacaguu 1800

uauuuguaaa guagcucugu gagagccacc augcccucug cccuugccuc uugggacuga 1860

ccaggagcug cucaugugcg ugagaguggg aaccaucucc uugcggcagu ggcuuccgcg 1920

ugccccgugu gcuggugcgg uucccaucac gcagacagga aggguguuug cgcacucuga 1980

ucaacuggaa ccucuguauc augcggcuga auucccuuuu uccuuuacuc aauaaaagcu 2040

acaucagacu gaugcucuuu cuccagauuc uuagucucac cucggccaca uggagccauu 2100

auccccauug gcagaaagau uuuucuuuaa aaaaaaagac uagaauaaca caagaaacca 2160

cauuuaggau uaugcuucac ucagaggagg caggcaggga ggacacacca ggggcuuuaa 2220

uacacugggc auguuuucuu ucuccaauug ggcaaugggu acauggacgu ucacuguaac 2280

gugcuuuuuc uuucgucuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu ugcuccuggc aagcugugcg 2340

ugacauucuu uauggcuuuu uguaugucaa auacuucaua cuaaacuuuc uagagaauua 2400

aacuuuaaug augggcucaa aaaaaaaaaa aa 2432

<210> 20

<211> 4583

<212> RNA

<213> 智人

<400> 20

gcggccgccc cggcggcucc uggaaccccg guucgcggcg augccagcca ccccagcgaa 60

gccgccgcag uucagugcuu ggauaauuug aaaguacaau aguugguuuc ccuguccacc 120

cgccccacuu cgcuugccau cacagcacgc cuaucggaug ugagaggaga agucccgcug 180

cucgggcacu gucuauauac gccuaacacc uacauauauu uuaaaaacau uaaauauaau 240

uaacaaucaa aagaaagagg agaaaggaag ggaagcauua cuggguuacu augcacuugc 300

gacugauuuc uuggcuuuuu aucauuuuga acuuuaugga auacaucggc agccaaaacg 360

ccucccgggg aaggcgccag cgaagaaugc auccuaacgu uagucaaggc ugccaaggag 420

gcugugcaac augcucagau uacaauggau guuugucaug uaagcccaga cuauuuuuug 480

cucuggaaag aauuggcaug aagcagauug gaguaugucu cucuucaugu ccaaguggau 540

auuauggaac ucgauaucca gauauaaaua aguguacaaa augcaaagcu gacugugaua 600

ccuguuucaa caaaaauuuc ugcacaaaau guaaaagugg auuuuacuua caccuuggaa 660

agugccuuga caauugccca gaaggguugg aagccaacaa ccauacuaug gaguguguca 720

guauugugca cugugagguc agugaaugga auccuuggag uccaugcacg aagaagggaa 780

aaacaugugg cuucaaaaga gggacugaaa cacggguccg agaaauaaua cagcauccuu 840

cagcaaaggg uaaccugugu cccccaacaa augagacaag aaaguguaca gugcaaagga 900

agaaguguca gaagggagaa cgaggaaaaa aaggaaggga gaggaaaaga aaaaaaccua 960

auaaaggaga aaguaaagaa gcaauaccug acagcaaaag ucuggaaucc agcaaagaaa 1020

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ugcugcuauc ucaaccagau gcccaggaca ggugcucuag ccauuaggac cacaaaugga 1200

caugucaguu auugcucugu cuaaacaaca uucccaguag uugcuauauu cuucauacaa 1260

gcauaguuaa caacaaagag ccaaaagauc aaagaaggga uacuuucaga ugguugucuu 1320

gugugcuucu cugcauuuuu aaaagacaag acauucuugu acauauuauc aauaggcuau 1380

aagauguaac aacgaaauga ugacaucugg agaagaaaca ucuuuuccuu auaaaaaugu 1440

guuuucaagc uguuguuuua agaagcaaaa gauaguucug caaauucaaa gauacaguau 1500

cccuucaaaa caaauaggag uucagggaag agaaacaucc uucaaaggac aguguuguuu 1560

ugaccgggag aucuagagag ugcucagaau uagggccugg cauuuggaau cacaggauuu 1620

aucaucacag aaacaacugu uuuaagauua guuccaucac ucucauccug uauuuuuaua 1680

agaaacacaa gagugcauac cagaauugaa uauaccauau gggauuggag aaagacaaau 1740

guggaagaaa ucauagagcu ggagacuacu uuugugcuuu acaaaacugu gaaggauugu 1800

ggucaccugg aacaggucuc caaucuaugu uagcacuaug uggcucagcc ucuguuaccc 1860

cuuggauuau auaucaaccu guaaacaugu gccuguaacu uacuuccaaa aacaaaauca 1920

uacuuauuag aagaaaauuc ugauuuuaua gaaaaaaaau agagcaagga gaauauaaca 1980

uguuugcaaa gucauguguu uucuuucuca augagggaaa aacaauuuua uuaccugcuu 2040

aaugguccac cuggaacuaa aagggauacu auuuucuaac aagguauauc uaguagggga 2100

gaaagccacc acaauaaaua uauuuguuaa uaguuuuuca aguuuuguuc acucuguuuu 2160

auuguuuguu uuauugagaa auucuuacuc uuagagacuc augaauuaag aaagagaauu 2220

cugcuaacuc agagaaccug guuccuaugu aauucagaau auauuacauu ucucaguaau 2280

auuuguuuuu ugaauccacc uuuaucugag ccaauggaga uuuacuuaua gcguauuagg 2340

agauauuuau uccauuuucu uauuuuaauc aacauucuaa uuauagacac augggccucc 2400

cuagcugauu ucacugcucc cccuucauug cuuagaaaug ggcaucauuu cuuguauguc 2460

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cuggacaccc guucuccacc aguuguacag uucauguaau cuacuuggcu uaauugauuu 2820

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ccaauguaua aaauaauucu aauuccauuu ucagcuaaaa cauauauuac caagaagaaa 3000

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ggaugauuuc auauaccauc uuucuucuga guguuaccca gucaaguaua aguagccaaa 3120

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ugguggcaaa ugacuaucag gucuucccau guguuugacu caaacuuauu acccuauggu 3300

ccuucugaca auggcagaag gucugaaucc uugaugcuaa acuuauauaa aaguagaauu 3360

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cuaucaaccu cugguaaagu uccuacacua gucacagaag guguuaacuu ucuacucuga 3600

uucugucucc auaauggggu aaacuguuga uaguuuaccc caucaacaga uggucgguaa 3660

auuauugauu cgaagaaucg agagagugca gcaacauaaa ucuguuaaug ucugaucaag 3720

cuccugcccu guucuccgaa uucagcuuca uaauuaaggg aaggccuguu uucuauccuc 3780

agauuuaggu ucuaguagca guuguguaac cacuagugag ucacuuaacu ccucuggguc 3840

cccauuucuc augugcaaca agaaagaggg gaacuggaga ugaucacucu aguuccagac 3900

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ugcguccuuu ggaaguuauc ccaacccugc uuuucucaaa agugaaaaug uauaggcucu 4020

cagaggagac agauuuaacu cugcuucucu aauguuauug aauuaaaagc uguucacauu 4080

agugguuauu aaauauugaa auaacacugg gaagaaaaag cauauauaaa uacagcuaaa 4140

aacaagaaua gauauucauu cucacaaagg gagacagcaa agaaaaugga aagugcacug 4200

gugcuagcgu uagacagcuu guguuaaugu cucaauucug cuacuaacug guugcagcuu 4260

gugugaccuu gggcacauug uaugaucucg cagaauauca ucccaaaucu gcaaaaugga 4320

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auaauaaaua uuuuguauau aaaugaauau caauuaaaag uuaugacuaa uuccacaagu 4440

caaacauaua aauuuuauuu cuugauucau gauaugugau aguauucaua aaaauguaca 4500

ugcaugauaa uuucaaggaa uaaguauaua ugugagaauc auggaaauga aauuaauaau 4560

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<210> 21

<211> 9648

<212> RNA

<213> 智人

<400> 21

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agaauugaga gcacgaugca uacacaggug uuucugagua guaauuagau cgcugugaag 120

gaaaaagcac accuuugagu uuucaccugu gaacacuaua gcgcugagag agacagucug 180

aaagcagagg aagacaucga ucaguaacac caagagacac caaaguugaa aguuuuguuu 240

ucuuucccuc uguuuuauuu uucccccgug ugucccuacu auggucagaa agccuguugu 300

guccaccauc uccaaaggag guuaccugca gggaaauguu aacgggaggc ugccuucccu 360

gggcaacaag gagccaccug ggcaggagaa agugcagcug aagaggaaag ucacuuuacu 420

gaggggaguc uccauuauca uuggcaccau cauuggagca ggaaucuuca ucucuccuaa 480

gggcgugcuc cagaacacgg gcagcguggg caugucucug accaucugga cggugugugg 540

gguccuguca cuauuuggag cuuugucuua ugcugaauug ggaacaacua uaaagaaauc 600

uggaggucau uacacauaua uuuuggaagu cuuuggucca uuaccagcuu uuguacgagu 660

cuggguggaa cuccucauaa uacgcccugc agcuacugcu gugauauccc uggcauuugg 720

acgcuacauu cuggaaccau uuuuuauuca augugaaauc ccugaacuug cgaucaagcu 780

cauuacagcu gugggcauaa cuguagugau gguccuaaau agcaugagug ucagcuggag 840

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uucugagcgg cuacugggaa auuucucauu agcaguuccg aucuuuguug cccucuccug 1260

cuuuggcucc augaacggug guguguuugc ugucuccagg uuauucuaug uugcgucucg 1320

agagggucac cuuccagaaa uccucuccau gauucauguc cgcaagcaca cuccucuacc 1380

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ucuuuugaau uuccucaguu uugccaggug gcuuuuuauu gggcuggcag uugcugggcu 1500

gauuuaucuu cgauacaaau gcccagauau gcaucguccu uucaaggugc cacuguucau 1560

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uuccacaccu uaauuaucau ucaacuugca aaagagacaa cugauaagaa gaaaauugaa 3060

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aagucagcca guaauuaaga aaaaaaguga uggagauuaa guaguauuuu ggcuuauuuu 4380

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acucaaaauu gcaguaugua aagcagauuc ucaaaaacuc uccugaacac uuauuuauau 4500

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acuguaauca gucuacagga aaaucauuau uuuaucuuga uuugcagaug aauauacugc 5280

uaagaaaggg agcaacucug accuuuguua aaguugaucu uuuguaauug agguauaagg 5340

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agguaacaau auuuuaaugu uaugcaauau agucagagaa auauuaaaaa uuaguuguuu 5460

gcugugcaua gguggaucuc gcaggaagcu aaugaaaccu aagcuucagu gccucucacu 5520

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ugugaguaaa guaaaauaau uccuguuauu uuuuucuguu agaaauaagu auggaggaua 5700

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cuugcuucac uuuacccucc auaauauguu guacauuagu gcugaucaag uuuacagagu 6000

uacauuuugc uuuccuaacc auucagucag gaauuaaaau auggcauugu auaacaacug 6060

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uuuacauuac uuguauaugg gcaaaauaau uauuaccuau acguguauuu aagcuuaauu 6180

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acuuaaaaau uauuuuuuaa uagucaauuu ugggagauaa uuauuucuuu ccuuauauuu 6720

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auuggccuua aaauacacag aggacgguua caguguccua auagcuguua caugugugug 7020

uuucagcgua cuugaaucaa guguacauuu auaguaccaa uaaccgccuu uacagcuuua 7080

caguuaacaa uucucucaca aaacuguaga gcauuaggca ucugagagcc auagagggcc 7140

aacuuuguuc cagagugaac augcuuuuuu uccucaacau auacacuacu gauuuuuuuu 7200

aaaaguauga cuuucaagug aauuaaugua uugguuagga gaacugcuug cuaaguccuu 7260

auuaccucuu guuaaagccu cagaaggccg ugcugaaagc cagaggggaa aaaaagagua 7320

augcacaggu aucucuuuug caguggugac uguauuuuga guaccuugug ugacagggua 7380

uuauuacagc aucuuguggg aaaaccuauu aggccuuugc auguuaaagc uguauaauuu 7440

guuggguugu gaguggucug acuuaaaugu guauuauaaa auuuagacau caaauuuucc 7500

uacuaacuaa cuuuauuaga ugcauacuug gaagcacagu cauaucacac ugggaggcaa 7560

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auuuuucccu agaauuucuc cuucauucca aaguacaaac auacuuugaa gaaugaaaca 7680

gauuguuccc augaauguau gcucauacuc gacuagaaac gaucuauguu aaaugacugu 7740

guauaugaau uauuucaagu acuaccccaa auaacuuucu uauugcucug aaagaagaaa 7800

agcaauguaa aucacuauga uuauugcaca aacaaccaga auucuccaac aauuuuaagu 7860

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uagaaucuau aguaguauca ggauauauuu ugcuuuaaaa uauauuuugg uuauuuugaa 8100

uacagacauu ggcuccaaau uuucaucuuu gcacaauagu augacuuuuc acuagaacuu 8160

cucaacauuu gggaacuuug caaauaugag caucauaugu guuaaggcug uaucauuuaa 8220

ugcuaugaga uacauuguuu ucucccuaug ccaaacaggu gaacaaacgu aguuguuuuu 8280

uacugauacu aaauguuggc uaccugugau uuuauaguau gcacauguca gaaaaaggca 8340

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agacaggauu ugacucaaua uuuguagagc uugcguagaa uggauuacau gguagugaug 8460

cacugguaga aaugguuuuu aguuauugac ucagaauuca ucucaggaug aaucuuuuau 8520

gucuuuuuau uguaagcaua ucugaauuua cuuuauaaag augguuuuag aaagcuuugu 8580

cuaaaaauuu ggccuaggaa ugguaacuuc auuuucaguu gccaaggggu agaaaaauaa 8640

uauguguguu guuauguuua uguuaacaua uuauuaggua cuaucuauga auguauuuaa 8700

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<210> 22

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<212> RNA

<213> 智人

<400> 22

cggcaccugg cgagcggagc cggagucggg cuggggaccg cggggucgag gccggaccgc 60

ggcggggucg ggggagaaac gcgcgcugcc cuggcacggg cccccccccc cggccgcgcg 120

gaaugguaug gcccggccgg aguuaaggcc ggggggaggc ggcgaguccc gcggcggcgg 180

cgacgauggg gcugcgugca ggaggaacgc ugggcagggc cggcgcgggu cggggggcgc 240

ccgaggggcc cgggccgagc ggcggcgcgc agggcggcag cauccacucg ggccgcaucg 300

ccgcggugca caacgugccg cugagcgugc ucauccggcc gcugccgucc guguuggacc 360

ccgccaaggu gcagagccuc guggacacga uccgggagga cccagacagc gugcccccca 420

ucgauguccu cuggaucaaa ggggcccagg gaggugacua cuucuacucc uuugggggcu 480

gccaccgcua cgcggccuac cagcaacugc agcgagagac cauccccgcc aagcuugucc 540

aguccacucu cucagaccua aggguguacc ugggagcauc cacaccagac uugcaguagc 600

agccuccuug gcaccugcug ccaccuucaa gagcccagaa gacacaccug gccuccagca 660

ggcugggcca ugcagaaggg auagcagggg ugcauucucu uugcaccugg cgagaggguc 720

ugacucuggg caccccucuc accagcuaca aggccuugga cucacuguac agugugggag 780

ccccaguucc caccucugug acaauaggau cauggccuua cccuugaagc auuaccgaga 840

aggagaacag agaugggcuu gaagagccac gugcugccgg cuccaaauuc ccaaggacaa 900

ggaucccucu gcauuuuugu cuauguaacc ucuuauaugg acuacauuca gcugcaagga 960

aaggaaaacc uugauugcag ugguuuaaac aaacagaaga uuguuuuucc acauagcaug 1020

gauucuggag auggguggcu aaugguauug guucaacaac uccacgaagg uaggggucac 1080

gucuuggauc cuuuugccuu aaucucagug cucguuacuu caugguccca agauggcugc 1140

uguaucccca agaaucaugu cugcguucaa ggaaggaggg guggaggaag aggaagggcc 1200

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ugcucucucc cucugcauau cuucacuuag augcccuugg cccgagccag cuaccauugc 1320

accucuagcu gcaaacaaag cuaagacagc agggaacaga auugucaugg cugaauagac 1380

caaucguguu ccaucuacug agacuggcac acugccuccu gcaauaaaac ugggauccca 1440

uuaccaagag agaaaugcag aauuguguac caguuagcuu uugcugugua acaaaccauc 1500

cccaaacuug gcagcuagaa acaaacccug uauuuuccca caauccuaug gguuggcaau 1560

uugggcuggg cucaacaggg caguucugcu gcucacaccu gggaucccuc auggagcuaa 1620

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cuagcucagg cuuauucaca ugauggcuuc aggauuccaa agagagugag aguagaagcu 1800

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acaugucuug augaggggaa ccacaaagag cuuguggcca uuuuucaccu aucacaaaua 1980

auuuuggaug gguauuuauu uggauaaagg uauuucccuc uucccccuuu cucucugucu 2040

cauggggccu cacucugcca aguuggaagg cacuaagaca uuguccuggc ccucaggguc 2100

uaggggaaga gguguugggg caggaaguga gucucuccau gggcuggacc cacuguagua 2160

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cgcgcccguc ccgucgccgc cgccgccgcc gcagaccccu cggucuugcu augucgagcu 60

cacccgugaa gcgucagagg auggaguccg cgcuggacca gcucaagcag uucaccaccg 120

ugguggccga cacgggcgac uuccacgcca ucgacgagua caagccccag gaugcuacca 180

ccaacccguc ccugauccug gccgcagcac agaugcccgc uuaccaggag cugguggagg 240

aggcgauugc cuauggccgg aagcugggcg ggucacaaga ggaccagauu aaaaaugcua 300

uugauaaacu uuuuguguug uuuggagcag aaauacuaaa gaagauuccg ggccgaguau 360

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ggcucaucga gcucuacaag gaagcuggga ucagcaagga ccgaauucuu auaaagcugu 480

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uugccuaaua cauuaaagca gucacuuuuc cugugcuguu ucaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1319

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caaaugcagg agggagaggu gccaagaagc agcgguacac agcaggcaca gagacacgug 240

gucuucagca gagccuaugg gguucagaug auucacauaa gaauagaagu uucagggcug 300

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gcggaaacuc aaguugaaug aaaaugccau cuccaggcuc caggcuaacc aaaagucugu 240

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aauaggaaga gaugcuugca caagaaaaau uggcuuagaa accguagggg ugaagauaaa 1380

ugaaaagacu ggaaaaauac cugucacaga ugaagaacag accaaugugc cuuacaucua 1440

ugccauuggc gauauauugg aggauaaggu ggagcucacc ccaguugcaa uccaggcagg 1500

aagauugcug gcucagaggc ucuaugcagg uuccacuguc aagugugacu augaaaaugu 1560

uccaaccacu guauuuacuc cuuuggaaua uggugcuugu ggccuuucug aggagaaagc 1620

uguggagaag uuuggggaag aaaauauuga gguuuaccau aguuacuuuu ggccauugga 1680

auggacgauu ccgucaagag auaacaacaa auguuaugca aaaauaaucu guaauacuaa 1740

agacaaugaa cguguugugg gcuuucacgu acugggucca aaugcuggag aaguuacaca 1800

aggcuuugca gcugcgcuca aauguggacu gaccaaaaag cagcuggaca gcacaauugg 1860

aauccacccu gucugugcag agguauucac aacauugucu gugaccaagc gcucuggggc 1920

aagcauccuc caggcuggcu gcugagguua agccccagug uggaugcugu ugccaagacu 1980

gcaaaccacu ggcucguuuc cgugcccaaa uccaaggcga aguuuucuag aggguucuug 2040

ggcucuuggc accugcgugu ccugugcuua ccaccgccca aggcccccuu ggaucucuug 2100

gauaggaguu ggugaauaga aggcaggcag caucacacug gggucacuga cagacuugaa 2160

gcugacauuu ggcagggcau cgaagggaug cauccaugaa gucaccaguc ucaagcccau 2220

gugguaggcg gugauggaac aacugucaaa ucaguuuuag caugaccuuu ccuuguggau 2280

uuucuuauuc ucguugucaa guuuucuagg guugaauuuu uuucuuuuuu cuccauggug 2340

uuaaugauau uagagaugaa aaacguuagc aguugauuuu uguccaaaag caagucaugg 2400

cuagaguauc caugcaaggu gucuuguugc auggaaggga uaguuuggcu cccuuggagg 2460

cuauguaggc uugucccggg aaagagaacu guccugcagc ugaaauggac uguucuuuac 2520

ugaccugcuc agcaguuucu ucucucauau auucccaaaa caaguacauc ugcgaucaac 2580

ucuagccaaa uuugccccug ugugcuacau gauggaugau uauuauuuua aggucuguuu 2640

aggaagggaa auggcuacuu ggccagccau ugccuggcau uugguaguau aguaugauuc 2700

ucaccauuau uugucaugga ggcagacaua caccagaaau gggggagaaa caguacauau 2760

cuuucugucu uuaguuuauu gugugcuggu cuaagcaagc ugagaucauu ugcaauggaa 2820

aacacguaac uuguuuaaaa guuuuucugg uagcuuuagc uuuaugcuaa aaaaaauaau 2880

gacauugggu aucuauuucu uucuaagacu acauuaguag gaaaauaagu cuuuucaugc 2940

uuaugauuua gcuguuuugu gguaauugcu uuuuaaagga aguuauuaau aucauaaguu 3000

auuauuaaua uuuugaacac agguggaugu gaaggauuuu cauuuaaaaa ccaagugguu 3060

uugacuuuuu cuguugaaug aacaacugug ccuuguggaa uuuuugcaga aguguuuaug 3120

cuuuguuagc auuucaacuu gcauuauuau aaagagguau uaaugccuca guuauguguu 3180

ugucaaugua cuggcugagg auucuaucuc agcugucuuu ucuaacugug uagguugagu 3240

uuugaacacg ugcuugugga caucaggccu ccugccagca guucuugaag cuucuuuuuc 3300

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gggccaccuc agggaaccca ugcaucugcc uggcauuuag gcagcagagc cccugaccgu 3420

cccccacagg gcucugccuc acguccucau cucauuuggc uguguaaaga aaugggaaaa 3480

gggaaaagga gagagcaauu gaggcaguug accauauuca guuuuauuua uuuauuuuua 3540

auuuguuuuu uucuccaagu ccaccagucu cugaaauuag aacaguaggc gguaugagau 3600

aaucaggccu aaucauguug ugauucucuu uucuuagugg aguggaaugu ucuaucccca 3660

caagaaggau uauaucuuau agacuugucu uguucagauu cuguauuuac ccauuuuauu 3720

gaaacauaua cuaaguucca uguauuuuug uuacaaaucu ucugaaaaaa aacaaaacaa 3780

ugugaaacau uaaaauuaaa aggcauuaau aauauccacg ugugccuucu uacugaaaaa 3840

aaaaaa 3846

<210> 28

<211> 3013

<212> RNA

<213> 智人

<400> 28

gugaaggaaa uagggaccug gcccugggcc uuguguagcg ggagggggag cuaggaagca 60

gcugagggca gaauccagga gggccuggcu gcgggggaau gaagccuccg ccuucgcagg 120

caaaagccuu uaaauacggg cucaggcccg ggacucagag uguaacgcgu ggcagccuga 180

gggaggggcg ugcgccgaga gggagcucag aucgagcggg gcgcgggugg agaagcugcg 240

gcggcgcggc ccguaggaag gugcuguccg aacgaucggg auaggagcgg ucccugcgcu 300

ugcugcuggg aagugguaca aucauguuug aaauuaagaa gaucuguugc aucggugcag 360

gcuauguugg aggacccaca uguaguguca uugcucauau guguccugaa aucaggguaa 420

cgguuguuga ugucaaugaa ucaagaauca augcguggaa uucuccuaca cuuccuauuu 480

augagccagg acuaaaagaa gugguagaau ccugucgagg aaaaaaucuu uuuuuuucua 540

ccaauauuga ugaugccauc aaagaagcug aucuuguauu uauuucugug cuguccaacc 600

cugaguuucu ggcagaggga acagccauca aggaccuaaa gaacccagac agaguacuga 660

uuggagggga ugaaacucca gagggccaga gagcugugca ggcccugugu gcuguauaug 720

agcacugggu ucccagagaa aagauccuca ccacuaauac uuggucuuca gagcuuucca 780

aacuggcagc aaaugcuuuu cuugcccaga gaauaagcag cauuaacucc auaagugcuc 840

ugugugaagc aacaggagcu gauguagaag agguagcaac agcgauugga auggaccaga 900

gaauuggaaa caaguuucua aaagccagug uuggguuugg ugggagcugu uuccaaaagg 960

auguucugaa uuugguuuau cucugugagg cucugaauuu gccagaagua gcucguuauu 1020

ggcagcaggu cauagacaug aaugacuacc agaggaggag guuugcuucc cggaucauag 1080

auagucuguu uaauacagua acugauaaga agauagcuau uuugggauuu gcauucaaaa 1140

aggacacugg ugauacaaga gaaucuucua guauauauau uagcaaauau uugauggaug 1200

aaggugcaca ucuacauaua uaugauccaa aaguaccuag ggaacaaaua guuguggauc 1260

uuucucaucc agguguuuca gaggaugacc aagugucccg gcucgugacc auuuccaagg 1320

auccauauga agcaugugau ggugcccaug cuguuguuau uugcacugag ugggacaugu 1380

uuaaggaauu ggauuaugaa cgcauucaua aaaaaaugcu aaagccagcc uuuaucuucg 1440

auggacggcg uguccuggau gggcuccaca augaacuaca aaccauuggc uuccagauug 1500

aaacaauugg caaaaaggug ucuucaaaga gaauuccaua ugcuccuucu ggugaaauuc 1560

cgaaguuuag ucuucaagau ccaccuaaca agaaaccuaa aguguagaga uugccauuuu 1620

uauuugugau uuuuuuuuuu uuuuuuuggu acuucaggau agcaaauauc uaucugcuau 1680

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ccuggcuaau uuuuuguauu uuuaguagag acaggguuuc accaugugag ccaggauggu 1920

cucaaucucc ugaccuugug aaccacccgu cucggccucc caaagugcug ggauuacagg 1980

ugugagccac cacgccuggc ccaugaacca aguguuuuua aggaaacaaa acuauuuuuu 2040

uaaucaucag auuuauacua gcuauaugga uauuagcaua ucugguaauu augaaucuag 2100

aauuuuuuua cauauuuuua uaauacuguu agcucaguua uuggaugagu gaaagauaau 2160

cauguugguu uuaauagugu caauuuuugu aaaauaaaaa uuaaacuuca aacucuuuac 2220

uuuauaaauu guccauaggc cacacuuuaa uaucacauua uaaagggaag gacagucuuc 2280

auuccuccug guuauugguu uguuugucau uaaagauaua uuuugaaucc augaaauugc 2340

uaugcuaaac agccuuuaca uguauggucu gguuaaaguu ccuuuguucc uuuuguuuua 2400

auaaaaugug ucacugauuu uuuagcucaa aaucaucacu guuaauuucc agucacccca 2460

aauaugguua aaagauuuuu uuuuuaauca ugaagagaaa auuaguagca uuucuuucuc 2520

uccccauuau uuauugguuu uccucacuaa ucuuuuuuuu uuuaguccaa aagccaaaaa 2580

uauuuaucuu gguuuuacau uuuaauuucc auucuuaauu guaauuuuuu ucuuuaaaua 2640

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guuuuauauu uucagugguu auuuuugcuu guguuagauc auuauuaaaa uauauccaau 2820

gucccuuuga uacuugugcu cugcugagaa uguacaguuu gcauuaaaca ucccaggucu 2880

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aaaaaaaaaa aaa 3013

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guaagaagcc agauguuaa 19

<210> 33

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Met Leu Glu Lys Phe Cys Asn Ser Thr Phe Trp Asn Ser Ser Phe Leu

1 5 10 15

Asp Ser Pro Glu Ala Asp Leu Pro Leu Cys Phe Glu Gln Thr Val Leu

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Val Trp Ile Pro Leu Gly Tyr Leu Trp Leu Leu Ala Pro Trp Gln Leu

35 40 45

Leu His Val Tyr Lys Ser Arg Thr Lys Arg Ser Ser Thr Thr Lys Leu

50 55 60

Tyr Leu Ala Lys Gln Val Phe Val Gly Phe Leu Leu Ile Leu Ala Ala

65 70 75 80

Ile Glu Leu Ala Leu Val Leu Thr Glu Asp Ser Gly Gln Ala Thr Val

85 90 95

Pro Ala Val Arg Tyr Thr Asn Pro Ser Leu Tyr Leu Gly Thr Trp Leu

100 105 110

Leu Val Leu Leu Ile Gln Tyr Ser Arg Gln Trp Cys Val Gln Lys Asn

115 120 125

Ser Trp Phe Leu Ser Leu Phe Trp Ile Leu Ser Ile Leu Cys Gly Thr

130 135 140

Phe Gln Phe Gln Thr Leu Ile Arg Thr Leu Leu Gln Gly Asp Asn Ser

145 150 155 160

Asn Leu Ala Tyr Ser Cys Leu Phe Phe Ile Ser Tyr Gly Phe Gln Ile

165 170 175

Leu Ile Leu Ile Phe Ser Ala Phe Ser Glu Asn Asn Glu Ser Ser Asn

180 185 190

Asn Pro Ser Ser Ile Ala Ser Phe Leu Ser Ser Ile Thr Tyr Ser Trp

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Tyr Asp Ser Ile Ile Leu Lys Gly Tyr Lys Arg Pro Leu Thr Leu Glu

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Asp Val Trp Glu Val Asp Glu Glu Met Lys Thr Lys Thr Leu Val Ser

225 230 235 240

Lys Phe Glu Thr His Met Lys Arg Glu Leu Gln Lys Ala Arg Arg Ala

245 250 255

Leu Gln Arg Arg Gln Glu Lys Ser Ser Gln Gln Asn Ser Gly Ala Arg

260 265 270

Leu Pro Gly Leu Asn Lys Asn Gln Ser Gln Ser Gln Asp Ala Leu Val

275 280 285

Leu Glu Asp Val Glu Lys Lys Lys Lys Lys Ser Gly Thr Lys Lys Asp

290 295 300

Val Pro Lys Ser Trp Leu Met Lys Ala Leu Phe Lys Thr Phe Tyr Met

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Val Leu Leu Lys Ser Phe Leu Leu Lys Leu Val Asn Asp Ile Phe Thr

325 330 335

Phe Val Ser Pro Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ile Ser Phe Ala Ser Asp

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Arg Asp Thr Tyr Leu Trp Ile Gly Tyr Leu Cys Ala Ile Leu Leu Phe

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Thr Ala Ala Leu Ile Gln Ser Phe Cys Leu Gln Cys Tyr Phe Gln Leu

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Cys Phe Lys Leu Gly Val Lys Val Arg Thr Ala Ile Met Ala Ser Val

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Tyr Lys Lys Ala Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ala Arg Lys Glu Tyr Thr

405 410 415

Val Gly Glu Thr Val Asn Leu Met Ser Val Asp Ala Gln Lys Leu Met

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Asp Val Thr Asn Phe Met His Met Leu Trp Ser Ser Val Leu Gln Ile

435 440 445

Val Leu Ser Ile Phe Phe Leu Trp Arg Glu Leu Gly Pro Ser Val Leu

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Ala Gly Val Gly Val Met Val Leu Val Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu

465 470 475 480

Ser Thr Lys Ser Lys Thr Ile Gln Val Lys Asn Met Lys Asn Lys Asp

485 490 495

Lys Arg Leu Lys Ile Met Asn Glu Ile Leu Ser Gly Ile Lys Ile Leu

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Lys Tyr Phe Ala Trp Glu Pro Ser Phe Arg Asp Gln Val Gln Asn Leu

515 520 525

Arg Lys Lys Glu Leu Lys Asn Leu Leu Ala Phe Ser Gln Leu Gln Cys

530 535 540

Val Val Ile Phe Val Phe Gln Leu Thr Pro Val Leu Val Ser Val Val

545 550 555 560

Thr Phe Ser Val Tyr Val Leu Val Asp Ser Asn Asn Ile Leu Asp Ala

565 570 575

Gln Lys Ala Phe Thr Ser Ile Thr Leu Phe Asn Ile Leu Arg Phe Pro

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Leu Ser Met Leu Pro Met Met Ile Ser Ser Met Leu Gln Ala Ser Val

595 600 605

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Ser Ala Ile Arg His Asp Cys Asn Phe Asp Lys Ala Met Gln Phe Ser

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Glu Ala Ser Phe Thr Trp Glu His Asp Ser Glu Ala Thr Val Arg Asp

645 650 655

Val Asn Leu Asp Ile Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Val Ile Gly Pro

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Phe Gly Thr Glu Phe Asn Glu Lys Arg Tyr Gln Gln Val Leu Glu Ala

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Glu Ile Gly Glu Lys Gly Ile Asn Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg

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Asp Asp Pro Leu Ser Ala Val Asp Ala His Val Gly Lys His Ile Phe

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Asn Lys Val Leu Gly Pro Asn Gly Leu Leu Lys Gly Lys Thr Arg Leu

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Glu Asp Asp Asp Tyr Gly Leu Ile Ser Ser Val Glu Glu Ile Pro Glu

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Leu Ser Arg Ser Ser Arg Ser Asn Gly Arg His Leu Lys Ser Leu Arg

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Lys Val Lys Phe Ser Ile Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Ala Ile Gly Leu

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Phe Ser Ile Phe Phe Ile Ile Leu Ala Phe Val Met Asn Ser Val Ala

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Val Met Ile Cys Met Ala Thr Pro Val Phe Thr Ile Ile Val Ile

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1130 1135 1140

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Arg Ile Asp Thr Asn Gln Lys Cys Val Phe Ser Trp Ile Thr Ser

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Asn Arg Trp Leu Ala Ile Arg Leu Glu Leu Val Gly Asn Leu Thr

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Val Phe Phe Ser Ala Leu Met Met Val Ile Tyr Arg Asp Thr Leu

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Ser Gly Asp Thr Val Gly Phe Val Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile

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Thr Gln Thr Leu Asn Trp Leu Val Arg Met Thr Ser Glu Ile Glu

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Thr Asn Ile Val Ala Val Glu Arg Ile Thr Glu Tyr Thr Lys Val

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Tyr Arg Pro Glu Leu Asp Leu Val Leu Arg Gly Ile Thr Cys Asp

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Pro Ile Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Met Asn Leu Asp Pro Phe

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Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Glu Ile Trp Lys Ala Leu Glu Leu Ala

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130 135 140

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<213> 智人

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Gly Asn Met Ile Ser Gly Lys Gly Thr Phe Leu Asp Ala Trp Glu Ala

130 135 140

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165 170 175

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Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Glu Thr

100 105 110

Ile Pro Ala Lys Leu Val Gln Ser Thr Leu Ser Asp Leu Arg Val Tyr

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Leu Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln

130 135

<210> 55

<211> 337

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

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1 5 10 15

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Ala Ile Asp Glu Tyr Lys Pro Gln Asp Ala Thr Thr Asn Pro Ser Leu

35 40 45

Ile Leu Ala Ala Ala Gln Met Pro Ala Tyr Gln Glu Leu Val Glu Glu

50 55 60

Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Lys Leu Gly Gly Ser Gln Glu Asp Gln Ile

65 70 75 80

Lys Asn Ala Ile Asp Lys Leu Phe Val Leu Phe Gly Ala Glu Ile Leu

85 90 95

Lys Lys Ile Pro Gly Arg Val Ser Thr Glu Val Asp Ala Arg Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Lys Asp Ala Met Val Ala Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Leu

115 120 125

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Lys

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 56

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (648)..(648)

<223> Xaa为吡咯烷酮羧酸

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<213> 智人

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340 345 350

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<213> 智人

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<211> 79

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<210> 69

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<400> 69

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再多了解一些
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