基于FraCactinoporin的用于生物聚合物传感和测序的生物纳米孔的制作方法

文档序号:17930532发布日期:2019-06-15 00:48
基于FraC actinoporin的用于生物聚合物传感和测序的生物纳米孔的制作方法

纳米孔代表了分析生物聚合物的有吸引力的方式,例如确定多肽或多核苷酸的身份,或估计聚合物中各个结构单元的身份以用于测序目的。这是因为该方法无标记物,提供了依赖于少量甚至单个分子的测量,并产生高度可缩放的电信号。

在利用纳米孔的测量系统中,系统的一些性质取决于纳米孔中的核苷酸,以及采用该性质的电测量。例如,通过将纳米孔置于绝缘膜中并在多核苷酸的核苷酸存在下测量通过纳米孔的电压驱动的离子流来产生测量系统。

纳米孔已成为单分子监测化学和酶促反应,蛋白质检测和核酸测序的有效方法[1],[2]。已显示Phi29[3]以及ClyA[4]允许双链DNA的迁移。最近,使用aerolysin来区分由腺嘌呤组成但长度不同的均聚物[5]。迄今为止,仅显示αHL和MspA能区分核酸。两个纳米孔在其跨膜区中具有β-折叠。当 DNA穿过MspA时,电流阻断水平受到四个或更多核苷酸的影响[6],而αHL 在其桶形结构中有三个传感区,可容纳约20个核碱基[7]。

本发明提供了具有不同结构和识别位点的新型纳米孔,其提供了测序精确度的改进和/或提供不同的误差分布。在这里,我们描述了Fragaceatoxin C(FraC)的纯化和预寡聚化,Fragaceatoxin C是一种来自actinoporin蛋白家族的成员的α-螺旋成孔毒素,与鞘磷脂复合并重建成由1,2-二植烷酰-sn-甘油 -3-磷脂酰胆碱(DPhPC)组成的平面脂质双层。本发明人进一步设计了一种 FraC突变体(例如ReFraC),其允许ssDNA的捕获和迁移以及区分用中性抗生物素蛋白(NA)固定的腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的均聚物。引人注目的是, dsDNA可以通过FraC迁移,很可能是经纳米孔的弹性变形的α-螺旋收缩。

值得注意的是,发现FraC纳米孔具有用于蛋白质测序和折叠蛋白质分析的理想形状。在下文中显示,电渗流是诱导蛋白质和多肽进入纳米孔内的主导力。通过精确改造纳米孔的收缩或通过改变溶液pH来调整纳米孔的内表面,可以观察到带正电荷和带负电荷的多肽的迁移。这是值得注意的,因为这表明在固定的施加电位下可以诱导足够强的电渗流来运送正和负残基。引人注目地发现是,一系列(未折叠的)不同大小的蛋白质,例如,在1.2-25kDa 范围内的蛋白质,可以根据个体阻塞进行区分。使用20个氨基酸的模型多肽,证明甚至通过纳米孔记录可以观察到单个氨基酸残基的差异,表明FraC 纳米孔允许鉴定迁移多肽中的特定序列特征。

此外,本发明人设计了一种在无鞘磷脂的平面脂质双层中重构预寡聚化的FraC纳米孔的方法。ReFraC纳米孔被改造为允许电泳DNA捕获并显示 ssDNA均聚物之间的区别。与用于测序DNA的其他纳米孔(例如αHL和 MspA)相反,FraC具有α-螺旋的V形跨膜区,这有利于微调核碱基辨别力。这是因为跨膜α-螺旋内不同位置的氨基酸取代可以调节收缩的大小和化学组成。

本文还显示ReFraC诱导DNA双链体在低施加电位下解链或允许它们在高施加电位下迁移。已经使用αHL纳米孔研究了DNA发夹或更高阶DNA 结构的解链[20],[21]。然而,ReFraC的顺式孔腔(5.5nm)比αHL(2.6nm)[13] 或MspA(4.8nm)[22]的顺式孔腔宽,表明FraC可以有利地用于研究较大的更高级的dsDNA结构,例如G-四链体,或折叠的RNA结构,例如tRNA。

因此,在第一方面,本发明提供了包含漏斗形蛋白质纳米孔的系统,所述纳米孔包含α-螺旋成孔毒素,其是来自actinoporin蛋白质家族的成员。更具体地,α-螺旋成孔毒素是Fragaceatoxin C(FraC),突变型FraC,FraC旁系同源物或FraC同系物。FraC可以优选在其C-末端与蛋白质亲和标签如His- 标签或Strep-标签融合。

使用突变型FraC可以获得非常好的结果。例如,突变型FraC包含在孔的狭窄部分的带负电荷的氨基酸残基中的至少一个取代成中性或带正电荷的氨基酸残基,和/或在孔的狭窄部分的中性氨基酸残中的至少一个取代成带正电荷的氨基酸残基。例如,突变体在跨膜螺旋中包含至少一个突变。优选地,至少一个带负电荷的氨基酸残基变为带正电荷的氨基酸残基。在优选的实施方案中,突变型FraC包含第10位的突变,优选突变Asp10Arg或 Asp10Lys(残基编号如晶体结构PDB ID 4TSY)。突变型FraC可以进一步包含一种或多种补偿性突变以恢复FraC的溶血活性,优选地,其中所述补偿性突变存在于第2、9、34、52、112、150、153和/或159位,和/或优选第 159位。例如,所述补偿性突变选自A2S,I9T,A34V,F52Y,W112L,T150I, G153D,K159E,I171T及其任意组合。在具体方面,突变型FraC(进一步) 包含第159位的突变,优选Lys159Glu。例如,使用FraC双突变体D10R/ K159E。

纳米孔可以位于第一液体介质和第二液体介质之间,其中至少一种液体介质包括分析物,并且其中所述系统可操作以检测分析物的性质。

在一实施方案中,所述系统可操作以使分析物迁移通过通道。在另一实施方案中,所述系统可操作以检测分析物的性质,其包括使纳米孔经受电场,使得分析物与纳米孔相互作用。施加的电位(其产生电场)是产生电流所必须的。电流是输出信号。例如,该系统可操作以检测分析物的性质,其包括使纳米孔经受电场,使得分析物通过电泳和/或电渗透迁移通过纳米孔和/或在纳米孔中被捕获。所述性质可以是分析物的电学、化学或物理性质。

优选地,纳米孔包含在(平面)脂质双层中。在具体方面中,脂质双层包含磷脂酰胆碱(PC),优选1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱,或由磷脂酰胆碱(PC),优选1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱组成。

在第二方面,本发明提供了一种用于提供本发明的系统的方法,其包括以下步骤:

-提供来自actinoporin蛋白家族的所述α-螺旋成孔毒素的重组单体;

-使所述单体与脂质体接触以将它们组装成寡聚物;

-从所述脂质体中回收所述寡聚物;以及

-使所述寡聚物与可能含有鞘磷脂的脂质双层接触,以允许形成纳米孔。

在第三方面,本发明提供了一种方法,包括向本文公开的系统施加电场,其中包含α-螺旋成孔毒素的漏斗形纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间。至少一种导电液体介质可包括分析物。所述方法可以进一步包括在包括以下的方法中检测分析物的步骤:在分析物与纳米孔相互作用时测量离子电流以提供电流模式,其中电流模式中阻塞的出现指示分析物的存在。所述方法可以进一步包括鉴定分析物,例如通过将电流模式与在相同条件下使用已知分析物获得的已知电流模式进行比较。分析物可以是核苷酸,核酸,氨基酸,肽,蛋白质,聚合物,药物,离子,污染物,纳米物体或生物战剂。

在一实施方案中,分析物是聚合物,例如蛋白质,肽或核酸。优选地,分析物是核酸,如ssDNA,dsDNA,RNA或其组合。在另一优选的方面,分析物是蛋白质,多肽或寡肽,例如大小为约1至约40kDa,优选约1至约 30kDa的蛋白质,多肽或寡肽。在一实施方案中,分析物是寡肽(约10个或更少的氨基酸),多肽(>10个氨基酸)或折叠的蛋白质(>50个氨基酸)。

在本发明的方法中,FraC纳米孔优选是突变型FraC纳米孔。通过突变型FraC纳米孔的通道的电导通常高于通过其相应的野生型FraC纳米孔的电导。

又一方面涉及突变型Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔,其包含至少第一突变型FraC单体,所述单体包含在孔的狭窄部分的带负电荷的氨基酸残基的至少一个取代为带正电荷的氨基酸残基和/或在孔的狭窄部分的中性氨基酸残基的至少一个取代为带正电荷的氨基酸残基。例如,突变体在跨膜螺旋中包含至少一个突变。优选地,至少一个带负电荷的氨基酸残基变为带正电荷的氨基酸残基。突变体可包含第3位或第10位的取代,或第3位和第10位的取代。在优选的实施方案中,突变型FraC包含第10位的突变,优选突变 Asp10Arg或Asp10Lys(残基编号如晶体结构PDB ID 4TSY)。突变型FraC可以进一步包含一个或多个补偿性突变以恢复FraC的溶血活性,优选地,其中所述补偿性突变存在于第2、9、34、52、112、150、153和/或159位,和 /或优选第159位。例如,所述补偿性突变选自A2S,I9T,A34V,F52Y, W112L,T150I,G153D,K159E,I171T及其任意组合。在具体方面,突变型FraC(进一步)包含第159位的突变,优选Lys159Glu。使用FraC双突变体 D10R/K159E可以获得非常好的结果。特别优选的突变体包括下文表3的那些。

突变型FraC纳米孔可进一步包含选自以下的至少第二单体:野生型 FraC单体,第二突变型FraC单体,野生型FraC旁系同源物或同系物单体,以及突变型FraC旁系同源物或同系物单体,其中第二突变型FraC单体可以与第一突变型FraC单体相同或不同。例如,第二单体是野生型FraC旁系同源物或同系物单体。在一实施方案中,突变型FraC纳米孔的第一突变型FraC 单体包含突变D10R,优选其中突变体选自表3中所示的突变体。

突变型FraC纳米孔优选通过通道的电导高于通过其相应的野生型FraC 纳米孔的通道的电导。

突变型FraC纳米孔可进一步包含分子马达,其中分子马达能够使分析物移入或穿过纳米孔,其平均迁移速度小于在没有分子马达的情况下分析物移入或穿过纳米孔的平均迁移速度。

例如,分子马达是酶,如聚合酶,核酸外切酶或Klenow片段。

对于蛋白质分析,优选具有从顺式至反式隔室的电渗流(EOF),其由带电收缩诱导。可以通过操纵分析物溶液的pH来获得与收缩相同电荷的氨基酸的迁移。使用一种或多种在低pH值(<约4.5)保持负电荷的非天然氨基酸是有利的,例如硫酸盐(SO42-)或磷酸盐(PO42-)部分是合适的氨基酸侧链基团。因此,还提供了纳米孔,其被改造成在负施加电位(pH4.5或更低)下具有从顺式到反式隔室的强电渗流。

本发明还提供了本文公开的系统或根据本发明的突变型FraC纳米孔用于生物聚合物传感和/或生物聚合物测序的用途。例如,所述生物聚合物是蛋白质,肽或核酸。优选地,提供如本文所公开的系统或根据本发明的突变型 FraC纳米孔用于核酸的传感和/或测序的用途,如ssDNA,dsDNA,RNA或蛋白质或多肽,或其组合。

例如,FraC纳米孔有利地用于识别蛋白质,多肽和寡肽生物标志物。一旦进入纳米孔,不同大小的蛋白质和多肽就可以通过离子电流来区分。虽然在迁移过程中无法实时鉴定单个氨基酸,但我们表明只有一个色氨酸残基不同的两种小的(未折叠的)寡肽内皮素1和内皮素2(2.5kDa),可以通过离子电流记录来区分。因此,如果例如,通过使用酶可以控制多肽的迁移,则FraC 纳米孔允许鉴定迁移多肽中的特定序列特征。

在一实施方案中,(突变型)FraC纳米孔用作单分子蛋白质组学分析中的传感器。在纳米孔蛋白质组学的最简单实施中,当蛋白质通过纳米孔线性迁移时,其被逐个氨基酸地识别。由于已知生物体中蛋白质和寡肽的序列来自基因组分析,因此可以通过比较在纳米孔中展开的迁移期间的特定蛋白质阻塞与已知蛋白质阻塞的数据库来简单地识别蛋白质。或者,折叠的蛋白质可以在其进入纳米孔孔腔内在纳米孔中迁移或未在纳米孔中迁移的情况下被识别。

附图说明

图1.野生型FraC(WtFraC)和D10R-K159E FraC(ReFraC)纳米孔,(A)通过八聚体WtFraC的横截面显示库仑表面着色(红色=负电荷,蓝色=正电荷)。标明了位于WtFraC收缩区的天冬氨酸残基10。(B)WtFraC(上图)和 ReFraC(下图)的顶视图。(C)WtFraC(蓝色)和ReFraC(红色)在1M NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5中+50mV时的单通道电导直方图。(D)在相同的采集设置(2 kHz低通贝塞尔滤波器和10kHz采样率)下获得的WtFraC(上图)和 ReFraC(下图)在3M NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5缓冲液中+100mV时的原始迹线。

图2.使用ReFraC的DNA辨别,(A)与NA复合的均聚DNA链使用 ReFraC的代表性阻塞。这幅图展示了电流阻塞的解释。(B)用ReFraC纳米孔针对A20,C20,T20均聚链获得的剩余电流的代表性分布。(C)由均聚C20和A20核苷酸针对同一ReFraC孔诱导的连续迹线的电流阻塞。显示的迹线用100Hz截止值进行数字过滤。(D)由C20和A20均聚链的混合物施加的剩余电流的分布。(E)用于分析均聚C20和T20核苷酸的混合物的实验的连续迹线。 (F)由C20和T20均聚链的混合物施加的剩余电流的分布。使用2kHz低通贝塞尔滤波器和10kHz采样率在3M NaCl,15mM Tris.HCl,pH 7.5中记录迹线。迹线C和E经受额外的100Hz高斯数字滤波。

图3.dsDNA通过ReFraC的解链/迁移,(A)ReFraC在+50mV下捕获 NA:A(dsDNA)C复合物的代表性迹线。开放孔电流表示为“1”,并且为了比较在捕获复合物后显示。在阻塞中可以观察到两个水平:首先,较低水平(“2”) 可能对应于均聚胞嘧啶,其通过中间水平(解链,括号)转化为更高水平(“3”),其最可能对应于均聚腺嘌呤。在电位反转(“4”)后,阻塞被立即释放,表明双链区NA:A(dsDNA)C复合物被剥离。(B)+100mV时,dsDNA部分被推过(变形,括号)后超过一半的情况(插图)观察到单个阻塞(“2”),并且在施加-30mV 时,阻塞不能被立即释放(“3”)。在较高的负电位下,可释放阻塞,表明形成了轮烷(图8中的更多实例)。使用2kHz低通贝塞尔滤波器和10kHz采样率在3M NaCl,15mM Tris.HCl,pH 7.5中记录迹线。

图4.确定WtFraC和ReFraC纳米孔的单一通道电导分布和电压电流依赖性。A:对在平面脂质双层中重构的WtFraC(上)和ReFraC(下)预寡聚化的孔测量的单一通道电导分布。在-50mV施加电位下测量电导。根据电导的不对称性验证每个单独通道的取向。B:测量WtFraC和ReFraC纳米孔的电压电流依赖性。实验重复3次,误差线表示实验值之间的标准差。记录在15mM Tris.HCl pH 7.5和1M NaCl中进行。

图5.WtFraC,D10R FraC和ReFraC的溶血活性。溶血速率计算为在 15mM Tris.HCl pH 7.5 150mM NaCl中的1%马红细胞悬浮液中观察到的浊度降低50%(测量为650nm波长下的光密度)所经过的时间的倒数。以200nM 浓度添加蛋白质,溶血率表示为WtFraC的百分比。实验重复3次,误差线表示实验值之间的标准差。

图6.用ReFraC纳米孔记录的A(dsDNA)C DNA底物的迁移和固定。

通过寡核苷酸I(5'生物素化的AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGCTACGACTCTCTGTGTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)和寡核苷酸 II(CACACA GAGAGTCGTAGCAC)退火制备A(dsDNA)C底物(描绘于迹线上方)。A:通过1μM单独的A(dsDNA)C(左)和与0.25μM中性抗生物素蛋白复合的A(dsDNA)C(右)在ReFraC纳米孔上引发阻塞,在+50mV施加电位下以顺式添加底物。B:通过1μM单独的A(dsDNA)C(左)和与0.25μM中性抗生物素蛋白复合的(右)A(dsDNA)C在ReFraC纳米孔上引发阻塞,在 +70mV下以顺式添加底物。检测到游离A(dsDNA)C阻塞的两个水平的剩余电流用淡紫色虚线表示。对应于堵塞孔和开放孔的电流水平分别显示为淡紫色和灰色虚线。电压步进方案显示为迹线下方的红线。记录在15mM Tris.HCl pH 7.5和3M NaCl中进行,采样频率为10kHz,并且在采集时通过2kHz低通贝塞尔滤波器平滑数据。

图7.代表性迹线显示在ReFraC纳米孔上引起的A(dsDNA)C-中性抗生物素蛋白阻塞内的剩余电流的逐步增强。1μM A(dsDNA)C和0.25μM中性抗生物素蛋白在+50mV以顺式存在。在阻塞内,剩余电流已从8.8±0.7%(初始水平)转变到12.5±0.7%(最终水平)。电压步进方案显示为底部的红线。记录在15mM Tris.HCl pH 7.5和3M NaCl中进行,采样频率为10kHz,并且在采集时通过2kHz低通贝塞尔滤波器平滑数据。

图8.显示在+100mV施加电位下驱动到ReFraC纳米孔中的 A(dsDNA)C-中性抗生物素蛋白形成轮烷的迹线的另外实例。以顺式加入 1μM A(dsDNA)C和0.25μM中性抗生物素蛋白。电压步进方案显示为底部的红线。通过将施加电位切换到-40mV来拆除轮烷。记录在15mM Tris.HCl pH 7.5和3M NaCl中进行,采样频率为10kHz,并且在采集时通过2kHz低通贝塞尔滤波器平滑数据。

图9.显示通过固定在ReFraC纳米孔内的寡核苷酸I-中性抗生物素蛋白形成假轮烷和轮烷的代表性迹线。A:由顺式存在的1μM寡核苷酸I和0.25μM 中性抗生物素蛋白引起的假轮烷形成。B:通过顺式存在的1μM寡核苷酸I 和0.25μM中性抗生物素蛋白形成轮烷,同时反式添加1μM寡核苷酸II。通过将施加电位切换到-40mV来拆除轮烷(迹线上方的红色箭头表示拆除轮烷)。描述dsDNA解链的瞬态在括号中显示。电压步进方案显示为底部的红线。记录在15mM Tris.HCl pH 7.5和3M NaCl中进行,采样频率为10kHz,并且在采集时通过2kHz低通贝塞尔滤波器平滑数据。

图10.用两种FraC变体在两种不同的pH条件下捕获寡肽(内皮素1)和蛋白质(胰凝乳蛋白酶)。a)野生型FraC(WtFraC,PDB:4TSY)和 D10R-K159E-FraC(ReFraC)的横截面。b-c)由1μM内皮素1(b)和200nM胰凝乳蛋白酶(c)针对WtFraC(左)和ReFraC(右)诱导的代表性迹线。胰凝乳蛋白酶 (PDB:5CHA)和人内皮素1(PDB:1EDN)显示为表面表示。内皮素1和胰凝乳蛋白酶在负施加电位下进入WtFraC,而它们在正施加电位下进入ReFraC。在-50mV下pH7.5和4.5时也观察到针对WtFraC的胰凝乳蛋白酶阻塞,然而,施加电位增加至-100mV以获得足够数量的阻塞。在pH7.5时,胰凝乳蛋白酶在正施加偏压下对ReFraC的阻塞比在负施加偏压下对WtFraC的阻塞需要更高的电位。pH7.5的缓冲液包含1M KCl,15mM Tris,pH4.5的缓冲液包含1M KCl,0.1M柠檬酸,180mM Tris.Base。将内皮素1和胰凝乳蛋白酶加入顺式隔室中。使用50kHz采样率和10kHz低通贝塞尔滤波器记录所有迹线。着色表示由APBS(13)(pH7.5,1M KCl)计算的分子表面的静电电位,其中红色和蓝色分别对应于负电位和正电位(范围-4至+4kbT/ec)。结构使用PyMOL着色。

图11.WtFraC和ReFraC的静电分布和离子选择性。a)单体平均模拟静电电位分别揭示了WtFraC和ReFrac的负电荷和正电荷收缩。将pH从7.5 降低到4.5,对于ReFrac只对静电电位产生很小的影响,而对于WtFraC,收缩中心的峰值下降约41%。所有模拟均使用APBS(13)在1M KCl下进行,每个可滴定残基的部分电荷根据它们的平均质子化状态用PDB2PQR软件修改版进行调整(14)。使用PROPKA估算残留的pKa值(33,34)。b)反转电位的测定表明,正如在其收缩时的静电位所预期的那样,WtFraC和ReFrac分别是阳离子和阴离子选择性的。根据模拟静电位的降低振幅,将pH从7.5降低到4.5使WtFraC(P_(K^+)/P_(〖Cl〗^-))的离子选择性降低约43%。相比之下,ReFraC在pH4.5时离子选择性增加约37%是模拟未预测到的。在不对称盐条件(反式467mM KCl和顺式1960mM KCl)下测量所有反转电位,并使用Goldman-Hodgkin-Katz方程测定离子选择性。详细的实验程序在支持信息中给出。每个电流-电压曲线之后的包络线代表它们各自的标准差。

图12.使用WtFraC在pH 4.5下的生物标志物表征。a)从上到下:胰凝乳蛋白酶(25kD,PDB:5CHA)分子表面的表面表示和图画表示(Pymol),在-150mV施加电位下获得的代表性迹线,描绘在-150mV下停留时间分布相对 Ires%的热图,Ires%的电压依赖性,停留时间的电压依赖性和捕获频率。b), c),d),e)分别显示β2-微球蛋白(11.6kD,PDB:1LDS),人EGF(6.2kD,PDB: 1JL9),内皮素1(2.5kD,PDB:1EDN)和血管紧张素I(1.3kD)的相同信息。血管紧张素I被描绘为用Pymol绘制的随机结构。生物标志物的浓度分别为:胰凝乳蛋白酶为200nM,β2-微球蛋白为200nM,人EGF为2μM,内皮素1 为1μM,血管紧张素I为2μM。生物标志物的等电点可从文献或在线计算工具Pepcalc获得。误差线表示从至少3次重复和每次重复至少300次事件获得的标准差。使用B样条函数(Origin 8.1)拟合数据。所有记录均采用50kHz 采样率和10kHz低通贝塞尔滤波器进行采集。

图13.用WtFraC在pH4.5下区分内皮素1和2。a)使用静电着色(PyMOL) 对内皮素1和内皮素2的分子表面表示。b)上图:内皮素1和2的氨基酸序列。蓝线表示每种寡肽中的二硫键。下图:在pH 4.5缓冲液(1M KCl,0.1M 柠檬酸,180mM Tris.Base)中,-50mV下内皮素1和内皮素2阻塞的Ires%和停留时间。c)代表性的内皮素1和内皮素2在-50mV的施用电位下对同一FraC纳米孔的阻塞。d)由2μM内皮素1引起的剩余电流的直方图(左)和相应的热图,其描绘了电流振幅相对Ires%(右)的标准差。e)与(d)中的相同,但是向同一孔添加8μM内皮素2后显示第二群体。图表使用自定义R脚本创建。所有记录均采用50kHz采样率和10kHz贝塞尔低通滤波器进行。

实验部分

A部分

材料和方法

除非另有说明,所有化学品均购自Sigma-Aldrich。DNA购自Integrated DNA Technologies(IDT)。从Fermentas获得酶并且从Avanti Polar Lipids获得脂质。这项工作中的所有误差都以标准差给出。

FraC克隆

为了进行克隆,在对应于来自A.fragacea的成熟WtFraC的DNA序列的起点(5'末端)引入Nco I限制性位点(CCATGG)。为了维持阅读框,在Nco I 位点后插入另外两个碱基,从而在起始甲硫氨酸后产生另外的丙氨酸残基。为了纯化目的,在FraC的C-末端,通过柔性甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸接头连接His9亲和标签,并且通过两个连续终止密码子终止开放阅读框,之后是 Hind III限制性位点(3'末端)。50ng具有优化密码子组成(IDT)的合成基因用作以下PCR反应的模板:在300μL体积中使用6μM引物Frf和Frr(表2),通过Phire Hot Start II DNA聚合酶(Finnzymes)扩增该基因。PCR方案如下:在98℃预孵育30秒,然后进行在98℃变性5秒,在72℃延伸1分钟,30 个循环。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化得到的含有带Hi9标签的 WtFraC基因PCR产物,并用Nco I和Hind III(FastDigest,Fermentas)消化。使用粘性末端连接(T4连接酶,Fermentas)通过Nco I(5')和Hind III(3')位点将凝胶纯化的插入物(QIAquick Gel Extraction Kit,Qiagen)克隆到pT7-SC1表达质粒的T7启动子控制下。通过电穿孔将连接混合物中的0.6μL转化到50μL E.10G细胞(Lucigen)。将转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂平板上于37℃生长过夜。通过测序确认克隆的身份。

10R FraC的构建

将含有WtFraC基因的pT7-SC1质粒中的100ng用作PCR反应的模板:在300μL体积中使用6μM引物10Rf(编码D10R)和T7终止子(表2),通过 Phire Hot Start II DNA聚合酶(Finnzymes)扩增该基因。PCR反应循环方案如下:在98℃预孵育30秒,然后在98℃变性5秒并在72℃延伸1分钟,30 个循环。凝胶纯化(QIAquick Gel Extraction Kit,Qiagen)PCR产物,并通过 MEGAWHOP程序[1]将其克隆到pT7表达质粒(pT7-SC1)中:将约500ng纯化的PCR产物与约300ng含有WtFraC基因的pT7-SC1质粒混合,并用Phire Hot Start II DNA聚合酶(Finnzymes)以最终体积50μL进行扩增(在98℃预孵育30 秒,然后在98℃变性5秒,在72℃延伸1.5分钟,30个循环)。通过与Dpn I(1FDU)在37℃孵育2小时来消除环形模板。通过电穿孔将所得混合物中的 0.6μL转化到E.10G细胞(Lucigen)中。转化的细菌在含有氨苄青霉素 (100μg/ml)的LB琼脂平板上于37℃生长过夜。通过测序确认克隆的身份。

通过易错PCR构建10R FraC文库

通过使用T7启动子和T7终止子引物从质粒DNA扩增D10R FraC基因来构建文库(表2)。

表2.本研究中使用的寡核苷酸

“5Biosg”代表通过C6接头(IDT)与DNA的5'末端缀合的生物素基团

在第一轮诱变中,我们使用含有编码10R FraC的合成基因的质粒作为模板。在第二轮诱变中,我们使用来自第一轮筛选中鉴定的具有最高活性的克隆的DNA质粒库。通过易错PCR进行DNA扩增:将400μL PCR混合物 (200μlREDTaqReadyMix,6μMT7启动子和T7终止子引物,约400ng质粒模板)分成含有0至0.2mM MnCl 2的8个反应体积,并循环27次(在95℃预孵育3分钟,然后循环:在95℃变性15秒,在55℃退火15秒,在72℃延伸 3分钟)。这些条件通常在最终文库中产生每个基因1-4个突变。将PCR产物合并在一起,凝胶纯化(QIAquick Gel Extraction Kit,Qiagen)并通过 MEGAWHOP程序克隆到pT7表达质粒(pT7-SC1)中:将约500ng纯化的PCR 产物与约300ng含有10R FraC基因的pT7-SC1质粒混合,并用Phire Hot Start II DNA聚合酶(Finnzymes)以最终体积50μL进行扩增(在98℃预孵育30秒,然后30个循环:在98℃变性5秒,在72℃延伸1.5分钟)。通过与Dpn I(1FDU) 在37℃孵育2小时来消除环形模板。通过电穿孔将所得混合物中的0.6μL转化到E.10G细胞(Lucigen)中。转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB 琼脂平板上于37℃生长过夜,通常产生>105个菌落,将其收获用于质粒DNA 文库制备。

在FraC过表达后筛选粗裂解物中的溶血活性

将来自600个克隆(见上文)的过夜种子培养物接种到新的96深孔板的 450μL新鲜培养基中,并使培养物在37℃生长至OD 600~0.8。然后,加入 IPTG(0.5mM)以诱导过表达,并将温度降至25℃,过夜孵育。第二天通过在 4℃下以3000×g离心15分钟来收获细菌。弃去上清液,将沉淀在-80℃冷冻 2小时,以促进细胞破碎。然后将细胞沉淀重悬于0.4mL裂解缓冲液(15mM Tris.HCl pH 7.5,1mM MgCl2,10μg/ml溶菌酶,0.2单位/mL DNAse I)中,并通过在37℃以1300RPM振荡30分钟来裂解。然后将粗裂解物中的0.5-5μL 加入100μL约1%马红细胞悬浮液中。后者通过将马血(bioMérieuxBenelux) 在4℃下以6000×g离心5分钟并在15mM Tris.HCl pH 7.5,150mM NaCl中进行沉淀重悬来制备。如果上清液呈红色,则将溶液再次离心,将沉淀重悬于相同的缓冲液中。通过随时间在650nm处OD的降低来监测溶血活性 (Multiskan GO Microplate Spectrophotometer,Thermo Scientific)。

筛选补偿FraC中D10R氨基酸取代的有害影响的突变

D10R氨基酸取代导致FraC的溶血活性降低约5倍(图5)。虽然D10R FraC仍然可以在由1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)制备的平面双层中寡聚并重建,但我们寻找将D10R FraC的溶血活性恢复到WtFraC水平的补偿性突变。维持FraC的溶血活性是重要的,原因有两个:首先,它反映了在靶向脂质双分子层上组装成寡聚孔的能力,因此可以转化为更有效的寡聚纳米孔的制剂。另一方面,溶血活性提供了筛选具有任意氨基酸序列变化的变体功能的便利方式,因此将有助于将来在FraC纳米孔上的改造工作。为了鉴定补偿性突变,我们构建了基于D10R FraC基因的随机诱变文库,将其转化至Bl21DE3大肠杆菌,并使用WtFraC作为参照筛选了过表达后的粗裂解物中个体变体针对马红细胞的溶血活性。在第一轮中,我们筛选了600 个变体并选择了12个克隆作为模板用于第二轮随机诱变并结合溶血活性筛选。然后,选择具有最高溶血活性水平的7个克隆用于进一步表征。表3总结了相应基因中发生的序列变化。

表3.补偿FraC中D10R突变的有害影响的序列变化

将纯化的变体在鞘磷脂:DPhPC(1:1)脂质体中寡聚化并溶解于0.6% LDAO中。在通过Ni-NTA层析将洗涤剂更换为0.02%DDM后,测试寡聚蛋白在由DPhPC组成的平面脂质双层中的成孔活性。最初,我们确定了命名为3,4和ReFraC(表3)的变体作为最有希望的成孔剂。然而,由变体3制备的纳米孔是不均匀的(小于50%产生八聚体孔),而变体4的成孔活性在4℃下保存数天就衰变。当在4℃下保存时,寡聚ReFraC维持成孔活性数月,并形成与WtFraC几乎一样均匀的纳米孔,同时能够捕获ssDNA。因此,我们在本研究中选择了ReFraC进行进一步的DNA分析。此外,我们用ReFraC 中的天冬酰胺取代天冬氨酸10,产生D10N K159E变体,但未检测到ssDNA 进入。

WtFraC(蛋白序列)

MASADVAGAVIDGAGLGFDVLKTVLEALGNVKRKIAVGIDNESGKTWTAMNTYFRSG TSDIVLPHKVAHGKALLYNGQKNRGPVATGVVGVIAYSMSDGNTLAVLFSVPYDYNW YSNWWNVRVYKGQKRADQRMYEELYYHRSPFRGDNGWHSRGLGYGLKSRGFMNSS GHAILEIHVTKAGSAHHHHHH**

WtFraC(DNA序列)

ATGGCGAGCGCCGATGTCGCGGGTGCGGTAATCGACGGTGCGGGTCTGGGCTTTGA CGTACTGAAAACCGTGCTGGAGGCCCTGGGCAACGTTAAACGCAAAATTGCGGTAG GGATTGATAACGAATCGGGCAAGACCTGGACAGCGATGAATACCTATTTCCGTTCTG GTACGAGTGATATTGTGCTCCCACATAAGGTGGCGCATGGTAAGGCGCTGCTGTATA ACGGTCAAAAAAATCGCGGTCCTGTCGCGACCGGCGTAGTGGGTGTGATTGCCTAT AGTATGTCTGATGGGAACACACTGGCGGTACTGTTCTCCGTGCCGTACGATTATAATT GGTATAGCAATTGGTGGAACGTGCGTGTCTACAAAGGCCAGAAGCGTGCCGATCAG CGCATGTACGAGGAGCTGTACTATCATCGCTCGCCGTTTCGCGGCGACAACGGTTGG CATTCCCGGGGCTTAGGTTATGGACTCAAAAGTCGCGGCTTTATGAATAGTTCGGGC CACGCAATCCTGGAGATTCACGTTACCAAAGCAGGCTCTGCGCATCATCACCACCAT CACTGATAAGCTT

FraC过表达和纯化

用含有FraC基因的pT7-SC1质粒转化E.EXPRESSBL21(DE3)细胞。在补充有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上于37℃过夜生长后选择转化体。将得到的菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素的2xYT培养基 (Sigma)中。培养物在37℃下以200rpm振荡生长,直至OD600达到约0.8。然后通过加入0.5mM IPTG诱导FraC的表达,并使其在25℃继续生长。第二天,通过6000×g离心25分钟收获细菌,并将沉淀于-80℃保存。将含有单体FraC的沉淀(来自50-100ml细菌培养物)解冻并重悬于40ml的15mM Tris.HCl pH 7.5,1mM MgCl 2和0.05单位/mL DNase I(Fermentas)中。然后,为了引发细胞破碎,向细菌悬浮液中补充0.2mg/ml溶菌酶和2M尿素(以防止碎屑形成),并在环境温度下剧烈振荡40分钟。通过探针超声破坏剩余的细菌。通过在6000xg离心20分钟澄清粗裂解物,并将上清液与用洗涤缓冲液(10mM咪唑150mM NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5)预平衡的200μL(珠体积)Ni-NTA树脂(Qiagen)混合。在环境温度下温和混合1小时后,将树脂上样到柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)并用约5ml洗涤缓冲液洗涤。用约0.5mL 含有300mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱FraC。通过Bradford法测定蛋白质浓度。在进一步使用前将FraC单体于4℃保存在。

溶血活性测定

将去纤维蛋白的马血(bioMérieuxBenelux)用150mM NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5洗涤直至上清液澄清。接着将红细胞用相同的缓冲液重悬至约1%浓度(OD 650nm 0.6-0.8)。然后将悬浮液与200nM的FraC混合。通过使用MultiskanTM GO微孔板分光光度计(Thermoscientific)监测OD650的降低来测量溶血活性。将溶血速率确定为1除以浊度降低50%所经过的时间。

鞘磷脂:DPhPC脂质体的制备

将20mg鞘磷脂(脑,猪,Avanti Polar脂质)和DPhPC(1:1)混合物溶解于4ml补充有0.5%乙醇的戊烷(以帮助溶解鞘磷脂)并将其置于圆底烧瓶中。蒸发溶剂,同时缓慢旋转烧瓶,以在壁上沉积脂质膜。在沉积脂质膜后,将烧瓶保持打开30分钟以使溶剂完全蒸发。然后使用超声浴(在环境温度下 5-10分钟)将脂质膜重悬于150mM NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5(总脂质的最终浓度10mg/ml)中。将获得的脂质体于-20℃保存。

FraC的寡聚化

将单体FraC与脂质体(脂质/蛋白质质量比10:1)在150mM NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5缓冲液中混合。将混合物短暂超声处理(超声浴)并在37℃下孵育30分钟。然后将蛋白脂质体用0.6%LDAO溶解并孵育5分钟,用含 DDM的洗涤缓冲液(0.02%DDM 150mM NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5)将混合物稀释20倍并与用含DDM的洗涤缓冲液预平衡的约100μl(珠体积)Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)混合。在温和混合1小时后,将树脂上样到柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)并用约2ml DDM洗涤缓冲液洗涤。用50μl洗脱缓冲液(200mM EDTA,0.02%DDM,pH8-或者我们可以使用1M咪唑0.02% DDM,然而,EDTA被证明更有效)从柱中洗脱FraC。将纯化的FraC寡核苷酸于4℃保存。

或者,可以通过将FraC单体与仅由鞘磷脂形成的脂质体混合(在37℃下 1小时,然后在4℃下过夜)来形成FraC寡核苷酸。第二天,将5mM EDTA 和1%DDM(最终)加入到蛋白脂质体中,并在室温下孵育15分钟。然后将溶液稀释至1ml体积(含有5mM EDTA,0.05%DDM 15mM Tris HCl 7.5 150mM NaCl)。然后用100kDa截留超滤装置将溶液浓缩至约100μl。

平面脂质双层中的电记录

施加的电位是指反式电极的电位。将FraC纳米孔从与接地电极连接的顺式隔室插入脂质双层中。两个隔室由25μm厚的聚四氟乙烯薄膜(Goodfellow Cambridge Limited)隔开,该薄膜含有直径约100μm的孔。用约 5μl含10%十六烷的戊烷预处理孔,并通过向两个电生理室中加入约10μL 的含1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)的戊烷(10mg/mL)来形成双层。通常,向顺式隔室(0.5mL)中加入0.01-10ng的寡聚FraC足以获得单一通道。WtFraC纳米孔在正施加电位时显示出比在负施加电位下更高的开放孔电流,这为确定孔的取向提供了有用的工具。电记录在1M(FraC纳米孔的初始表征)和3M NaCl(用于增加振幅的多核苷酸分析),15mM Tris.HCl pH 7.5 中进行。

数据记录和分析

使用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments)放大来自平面双层记录的电信号,并用Digidata 1440A/D转换器(Axon Instruments)数字化。使用Clampex 10.4软件(Molecular Devices)记录数据,随后用Clampfit软件 (Molecular Devices)进行分析。通过应用2kHz低通贝塞尔滤波器和10kHz采样率获得电记录。使用Clampfit中的“单通道搜索”功能分析从0级到1级的电流转换。由阻塞孔电流值(IB)和开放孔电流值IO)计算剩余电流值(Ires)为Ires=100*IB/IO。从高斯拟合到事件的振幅直方图来确定IB和IO。在事件显示逐步电流增强的情况下,从高斯拟合到整点电流直方图计算剩余电流水平。为了确定事件寿命,事件停留时间(toff)被合并为累积分布并且拟合为单个指数。显示逐步电流增强(图3A)和轮烷形成阻塞的事件频率是手动计算的。使用Origin(OriginLab Corporation)或Clampfit软件(Molecular Devices)制图。

FraC纳米孔的图示

用Chimera(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera)进行分子制图。

实施例1:平面脂质双层中野生型FraC孔的重建。

在BL21(DE3)大肠杆菌菌株中表达C末端与Hi9标签基因融合的重组野生型FraC(WtFraC,图1A;1B,顶部)蛋白质单体。以前的工作确定了actinoporin的孔组装是由脂质双层中SM的存在引发的[9],[10],[11],[8]。一致的是,通过Ni-NTA层析纯化的WtFraC的水溶性单体在DPhPC平面脂质双层中不形成孔。因此,我们用DPhPC:SM(1:1)脂质体使单体预寡聚化。在将脂质体溶解在0.6%N,N-二甲基十二烷胺N-氧化物(LDAO)中来防止寡核苷酸解离后[12],通过第二轮Ni-NTA层析(SI)将LDAO交换为0.02%十二烷基-β-麦芽糖苷(DDM)。向DPhPC平面脂质双层的顺式侧添加在 0.02%DDM中纯化的亚微克量的寡聚WtFraC容易产生孔。在1M NaCl, 15mM Tris.HCl pH 7.5缓冲液中WtFraC孔的单一通道电导的分布显示主要是单电导型(图1C;4A,顶部),可能对应于在最近确定的晶体结构中观察到的八聚体[8]。与其他生物纳米孔类似,WtFraC通道显示出不对称的电流- 电压(I-V)关系(图4B),允许确定孔的取向。图1D顶部显示在3M NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5缓冲液中获得的示例性迹线。

实施例2:用于核酸分析的WtFraC的改造

八聚体WtFraC的晶体结构表明,这种纳米孔足够大,可以穿过 ssDNA(1.2纳米的收缩直径)[8]。然而,在我们的初始实验中,我们无法观察到ssDNA阻塞,很可能是因为WtFraC孔的负电荷收缩区阻止了DNA迁移 [13],[14]。为了诱导ssDNA穿过FraC,我们用精氨酸取代了天冬氨酸10,从而制备了带有正电荷收缩的纳米孔(图1B,底部)。因为D10R FraC显示出低的成孔活性(图5),我们对D10R FraC基因的背景进行了随机诱变,并筛选了所获得变体(SI)的溶血活性。结果,我们鉴定了赖氨酸159至谷氨酸的补偿性突变(K159E),其位于宽孔腔的外缘(图1A)。FraC的双突变体D10R, K159E(ReFraC)显示接近野生型水平的溶血活性(图5)并产生均匀的孔(图 1C),尽管与WtFraC相比具有改变的I-V关系(图4B和图1D,底部)。在1M NaCl,15mM Tris.HCl pH 7.5中ReFraC孔在±50mV处的较低电导可归因于较窄的收缩,因为精氨酸具有比天冬氨酸更庞大的侧链(图1B)。

实施例3:利用ReFraC的多核苷酸辨别

我们遵循利用αHL[7],[15],[16],[17]和MspA[14],[18]的既定方法,用中性抗生物素蛋白(NA)来固定DNA。我们将5'-末端生物素化的 A20/C20/T20ssDNA均聚物与四聚体NA复合,以评估ReFraC迁移和辨别 DNA链的能力。我们添加了预先混合的DNA(1μM)和NA(0.25μM)至平面脂质双层装置的顺式隔室,并在3M NaCl,15mM Tris.HCl,pH 7.5缓冲液和 +70mV施加电位(参见反式电极)中进行DNA辨别实验。我们观察到永久性电流阻塞,其由假轮烷引起,其中ssDNA稳定地穿过孔,直到施加的电位反转(图2A,9A)。剩余电流Ires,即阻塞和开放的孔电流振幅乘以100的百分比((IB/IO)×100)如下:NA:A20为13.1±0.4%(N=5,n=364,其中N是多个独立的单孔实验的数量,n是分析的阻塞),NA:C20为10.8±0.3%(N=4, n=920),NA:T20为14:0±0.3%(N=5,n=780)(图2B)。为了排除孔间变化的影响,我们还解析了均聚物的混合物(图2C-F)。剩余电流相对较低表明穿过的ssDNA周围的孔紧密闭合。

实施例4:通过ReFraC纳米孔的DNA解链和双链DNA迁移

ReFraC(1.2nm)的收缩小于B型双链DNA(dsDNA,约2nm)。因此,为了评估dsDNA作为DNA分析的终止剂,我们设计了两种寡核苷酸:在5'- 末端连接生物素基团的具有序列bio-5'-A20-GTGCTACGACTCTCTGTGTG -C20-3'的寡核苷酸I和具有寡核苷酸I的下划线部分的反向互补序列的短寡核苷酸II。退火产生A(dsDNA)C底物:dsDNA的20个碱基对长的中心区段,侧翼为A20和C20ssDNA区段。在+50mV处向顺式隔室添加1μM A(dsDNA)C导致ReFraC孔瞬时阻塞(阻塞寿命2±5秒,Ires=10.0±0.2%,N=3,n=290,图6A,左侧)。将施加的电位增加到+70mV将阻塞寿命缩短到 2.9±0.4ms(注意,剩余电流显示两个电流水平:12.8±0.6%和3.5±0.5%N=3n =2700图6B,左侧)。阻塞寿命随电位的降低表明A(dsDNA)C通过ReFraC 迁移。为了证明DNA迁移,我们在顺式室中添加了NA。NA:A(dsDNA)C 阻塞在|+50mV(图6A,右侧)和+70mV(图6B,右侧)处都是永久性的,因此表明在没有NA的情况下,瞬时阻塞不能由A(dsDNA)C收缩至顺式隔室引发。奇怪的是,+50mV时,31±4%的NA:A(dsDNA)C阻塞(N=3,n=468) 显示出剩余电流从瞬时水平(图3A,状态“2”,Ires=8.8±0.7%)逐步增强至稳定水平(图3A,状态“3”,Ires=12.5±0.7%,N=4,n=46;图7中的更多实例)。状态“2”的电流水平略低于NA:C20的电流水平(Ires=10.5±0.7;N=3, n=206,+50mV)。状态“3”的电流水平与NA:A20的电流水平相似。上述电流增强的可能解释是+50mV时,NA:A(dsDNA)C的C20区段停留在纳米孔的收缩区(图3A,状态“2”),其中双链体区段阻止进一步迁移。然而,在双链体解链后,A20占据了ReFraC的收缩区,其中NA阻止了迁移(图3A,状态“3”)。一致的是,+50mV时,当电位反转至-30mV时,NA:A(dsDNA)C 阻塞立即缓解,表明+50mV时,A(dsDNA)C的迁移是通过解链来介导的(图 3A,括号)。

相比之下,+70mV时,很大一部分阻塞在-30mV时没有立即释放(图3B,插图),表明形成了互锁状态(图3B,状态“2”和“3”)。此外,随着电位的增加,这些互锁状态更频繁地产生(例如,从+70mV时所有阻塞的7±4%至+100mV 时的54±14%,N=3,n=739;图3B,插图)。考虑到单独与NA复合的寡核苷酸I的阻塞在-30mV时立即释放(图9A),我们将这种互锁状态归因于轮烷,其中NA和A(dsDNA)C的双链体DNA片段分别用作顺式和反式终止剂(图3B,右侧)。预期到的是,这种轮烷也可以通过添加反式寡核苷酸II 而由NA:寡核苷酸I顺式阻塞形成(图9B)。将电位切换至-40mV快速拆解轮烷,可能是通过反式dsDNA终止剂的解链(图8和9B)。由顺式存在的 NA:A(dsDNA)C形成轮烷需要ReFraC孔的变形,以允许A(dsDNA)C底物的双链体区段的迁移(图3B,括号)。

这种结构柔韧性可能是α-螺旋孔的一般特征。以前,我们观察到人凝血酶(直径约4.2nm)对I型ClyA-CS纳米孔(约3.3nm收缩直径)的阻塞,之后是开放孔电流的瞬时增加[19]。这种现象被解释为通过ClyA的变形收缩而使蛋白质迁移。

针对A部分的参考文献

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B部分

上文A部分显示来自actinoporin蛋白家族Fragaceatoxin C(FraC)的α-螺旋成孔毒素有利地用于多核苷酸分析。

B部分证明FraC纳米孔也适用于识别蛋白质,例如寡肽(约10个或更少个氨基酸),多肽(>10个氨基酸)和折叠蛋白质(>50个氨基酸)形式的生物标志物。

材料

胰凝乳蛋白酶(来自牛胰腺,≥85%,C4129),β2-微球蛋白(来自人尿液,≥98%,M4890),内皮素1(≥97%,E7764),内皮素2(≥97%,E9012),血管紧张素I(≥90%,A9650),戊烷(≥99%,236705)和十六烷(99%,H6703),盐酸盐(批号#SLBG8541V)和碱(批号#SLBK4455V),N, N-二甲基十二烷胺N-氧化物(LADO,≥99%,40234)和正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM,≥98%,D4641)获自Sigma-Aldrich。人EGF(≥98%,CYT-217) 获自PROSPEC。1,2二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC,850356P)和鞘磷脂(Brain,Porcine,860062)购自Avanti Polar脂质。从Fluka购买氯化钾 (≥99%,批号#BCBL9989V)。从ACROS获得柠檬酸(≥99%,批号# A0365028)。所有多肽生物标志物和化学品直接使用而未进一步纯化。

注意:使用来自方案的配方制备下面使用的15mM Tris,pH 7.5 缓冲液:1.902gHCl和0.354g碱溶解在1升H2O中,得到 15mM Tris,pH 7.5。

方法

FraC单体表达和纯化

使用NcoI和HindIII限制性消化位点将编码具有C末端His6标签的FraC 的基因克隆到pT7-SC1表达质粒1中。为了表达,通过电穿孔将质粒转化到 E.EXPRESS BL21(DE3)感受态细胞中。在37℃过夜孵育后,从含有 100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板收获转化体,并将其接种到含有100mg/l 氨苄青霉素的200ml新鲜液体2-YT培养基中。细胞培养物在37℃下以 220rpm振荡生长,直至600nm的光密度为0.8,然后向细胞培养物中加入 0.5mM IPTG。将温度降至25℃以诱导FraC蛋白表达12小时。通过在4℃下4,000RP离心30分钟来回收细胞,并将细胞沉淀保持在-80℃。在室温下解冻50-100ml细胞培养物沉淀,用30ml裂解缓冲液(15mM Tris pH 7.5,1mM MgCl 2,4M尿素,0.2mg/ml溶菌酶和0.05单位/ml DNase)重悬并使用vertex 振荡器剧烈混合1小时。为了完全破碎细胞,将悬浮液超声处理2分钟(占空比10%,Branson Sonifier 450的输出控制3)。然后将粗裂解物在4℃下以 6,500RPM离心20分钟。将上清液(含有FraC单体)转移到含有100μl Ni-NTA 树脂(Qiagen,保存于4℃,并在移取100μl之前悬浮)的50ml falcon管中,并在室温下通过温和混合来孵育1小时,其中falcon管用3ml洗涤缓冲液 (10mM咪唑,150mM NaCl,15mM Tris,pH7.5)预洗涤。将树脂在4℃下以 4,000RPM旋转5分钟。弃去大部分上清液,将在约5ml缓冲液中含有Ni-NTA 树脂的颗粒于室温下转移至Micro Bio Spin柱(Bio-Rad)。用10ml洗涤缓冲液洗涤Ni-NTA珠,并用500μl 300mM咪唑洗脱蛋白质。用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。将单体在4℃保存。

鞘磷脂-DPhPC脂质体的制备

将20mg鞘磷脂(脑,猪,Avanti Polar脂质)与20mg 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC,Avanti Polar脂质)混合并溶解于含有0.5%v/v乙醇的4ml戊烷(Sigma)中。将该脂质混合物置于圆形烧瓶中并在吹风机附近缓慢旋转以使脂质充分分散在壁周围以蒸发溶剂。将烧瓶在室温下再打开30 分钟,使溶剂完全蒸发。然后将4ml缓冲液(150mM NaCl,15mM Tris,pH7.5) 加入到干燥的脂质中,并将烧瓶放入超声浴中5分钟。脂质体溶液于-20℃保存。

FraC的寡聚化

冷冻脂质体在解冻后进行超声处理,并与单体FraC以1:1的质量比混合。将FraC和脂质体混合物在水浴中超声处理约30秒,然后在37℃下保持 30分钟。蛋白质-脂质体用0.6%LADO(N,N-二甲基十二烷胺N-氧化物,5% w/v储备水溶液)溶解,然后转移到50ml falcon管中,并用缓冲液(150mM NaCl,15mM Tris,pH 7.5,0.02%DDM)稀释20倍。将100μl预洗涤的Ni-NTA 树脂(Qiagen)加入稀释的蛋白质/脂质体混合物中。在温和摇动孵育1小时后,将珠上样到柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad),用10ml缓冲液(150mM NaCl,15mM Tris,pH7.5)洗涤。用300μl洗脱缓冲液(200mM EDTA,75mM NaCl,7.5mM Tris,pH 8,0.02%DDM)洗脱FraC寡核苷酸。寡核苷酸可在4℃下稳定数周。

平面脂质双层中的电记录

如前所述进行电记录2。简而言之,两个室由25μm的聚四氟乙烯膜 (Goodfellow Cambridge Limited)隔开,该膜包含直径约100μm的孔。将两个银/氯化银电极浸没在电生理室的每个隔室中,其中填充有0.5ml缓冲液。接地电极连接到顺式隔室,工作电极连接到反式侧。为了形成脂质双层,将约 5μl十六烷溶液(10%v/v十六烷于戊烷中)加入到聚四氟乙烯膜中。约2分钟后,将10μl含10mg/ml 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)的戊烷溶液直接加入到两个隔室的缓冲液中。然后通过降低Teflon膜中孔上方和下方的缓冲液自发形成脂质双层。将FraC寡核苷酸加入到顺式侧。在施加电位下,FraC的离子电流是不对称的,这有助于评估脂质双层中FraC纳米孔的取向。当在负施加电位下测量到更高的电导时,FraC纳米孔显示出如图 10中所示的取向。然后将分析物添加到顺式室中。根据pH,本研究中使用两种缓冲溶液进行电生理记录。在pH 7.5下,使用1M KCl和15mM Tris进行记录。当pH从7.5变化到4.5时,使用的缓冲液含有1M KCl,0.1M柠檬酸和180mM Tris.Base。从pH 4.5到7.5,FraC和ReFraC寡核苷酸可以插入脂质双层中。

数据记录和分析

使用膜片钳放大器(Axopatch 200B,Axon Instruments)收集平面双层记录,并用Digidata 1440A/D转换器(Axon Instruments)将数据数字化。通过使用Clampex 10.4软件(Molecular Devices)获得数据,随后使用Clampfit软件 (Molecular Devices)进行分析。通过“单通道搜索”功能检测事件持续时间(停留时间),两个事件之间的时间(事件间时间),阻塞的电流水平和开放孔水平。阻塞的电流水平被称为IB,而开放孔电流被称为IO。Ires%,定义为(IB/IO)* 100,用于描述由不同生物标志物引起的阻塞程度。平均事件间时间是通过合并事件间时间并对累积分布应用单指数拟合来计算的。

离子选择性测量

使用Goldman-Hodgkin-Katz方程(下文中的方程式(1))计算离子渗透率 (K+/Cl-),其使用反向电位(Vr)作为变量输入。如下使用不对称盐浓度条件从 I-V曲线外推来测量Vr:在两个室中使用相同的缓冲液重建单个FraC纳米孔(对称条件:840mM KCl,15mM Tris,pH7.5,500μl)以评估纳米孔的取向。将含有3.36M KCl,15mM Tris,pH7.5的400μl溶液缓慢加入到顺式室中,并将400μl不含KCl的缓冲溶液(15mM Tris,pH7.5)加入到反式溶液中(反式: 顺式,467mM KCl:1960mM KCl)。将溶液混合并从-30mV至30mV以1mV 阶梯收集I-V曲线。使用相同的方法,但使用0.1M柠檬酸缓冲溶液,在pH4.5 下进行实验。最初,将500μl 840mM KCl,0.1M柠檬酸,180mM Tris.Base 的缓冲液加入到两个室中,并获得单个FraC通道。然后,将含有3.36M KCl, 0.1M柠檬酸,180mM Tris.Base的400μl pH4.5溶液缓慢加入到顺式室,并将400μl不含KCl的缓冲溶液(0.1M柠檬酸,180mM Tris.Base,pH 4.5)加入到反式溶液中(因此产生反式:顺式比为467mM KCl:1960mM KCl)。将溶液混合并从-30mV至30mV以1mV阶梯收集I-V曲线。还通过在反式室中使用高KCl浓度和在顺式室中使用低KCl浓度来测试离子选择性的方向性。用含有2.5M NaCl的2.5%琼脂糖桥包围Ag/AgCl电极。

实施例5:用FraC纳米孔捕获多肽和蛋白质

为了评估FraC纳米孔作为寡肽生物标志物的传感器,我们首先选择内皮素1(21个氨基酸的寡肽,2.5kD)和α-II-胰凝乳蛋白酶(以下称为胰凝乳蛋白酶,245个氨基酸的球状蛋白,25kD)(图10)。使用1M KCl,15mM Tris, pH 7.5溶液将分析物添加到野生型FraC(WtFraC)纳米孔(图10A)的顺式侧,并将外部电位施加到位于反式隔室中的“工作”电极。因为WtFraC显示门控高于约+50mV,但在高达-300mV的电位下稳定,所以我们施加在这些极限之间的电位。向顺式隔室中添加1μM的内皮素1不会在±50mV(图10B)和高达-300mV时引起阻塞。由于ClyA的收缩区内衬有天冬氨酸残基(图10A),我们推断这些残基在更强酸性条件下的质子化应该会减少内皮素1(携带净电荷为-2)迁移通过WtFraC收缩区的能量障碍。同时,在负施加电位下,负电荷较少的内皮素1也将更容易地向反式电极迁移。内皮素1阻塞在pH 6.4 开始出现,并且它们的捕获频率随着pH的降低而线性增加(从pH 6.4时的 0.6±0.2事件s-1μM-1到pH 4.4时的10.8±2.3事件s-1μM-1)。在pH 4.5(1M KCl, 0.1M柠檬酸,180mM Tris.Base)下,-50mV时观察到内皮素1对WtFraC的阻塞(Ires%:9.1±0.1%,停留时间:5.6±2.0ms,事件间时间:5.8±0.7ms),但在+50mV则没有观察到(图10B)。

受到在酸性条件下更积极的收缩效应的启发,我们接下来研究了用 D10R,K159EFraC(ReFraC)纳米孔捕获内皮素1,该纳米孔在上文A部分中用于DNA分析目的而改造的收缩区具有精氨酸残基。与WtFraC相反, ReFraC在正施加电位下稳定,但在约-50mV的电位下显示门控。因此,我们仅向ReFraC施加-50mV至+200mV的电压。pH7.5下,+50mV时向顺式隔室中加入1μM内皮素1引起阻塞(停留时间:3.3±2.2ms,事件间时间: 1413±223ms)但在-50mV时没有观察到(图10B)。降低至pH 4.5(1M KCl,0.1M 柠檬酸,180mM Tris.Base)导致捕获频率在+50mV时增加(图10B,停留时间: 8.5±1.8ms,事件间时间:402±79ms),尽管朝向反式电极的电泳迁移率降低。

接下来,测试蛋白质胰凝乳蛋白酶(pI 8.75,Sigma)作为相对大的蛋白质分析物的实例。在pH7.5缓冲液(1M KCl,15mM Tris)中,-50mV时观察到蛋白质阻塞,但是当我们将电位增加到-100mV时它们变得均匀(45.2±19.1 事件s-1μM-1,停留时间:12.0±5.7ms),而在正施加电位时未观察到捕获(图 10C)。与用内皮素1观察到的相反,胰凝乳蛋白酶的捕获频率在pH 7.5至 5.5之间保持恒定(pH 7.5时,45.2±19.1事件s-1μM-1;pH 6.4时,50±22.6事件s-1μM-1;pH5.5时,45.2±20.6事件s-1μM-1),并且当pH降至4.4时,捕获频率下降(pH4.4时,20.8±5.3事件s-1μM-1)。使用ReFraC在pH7.5时,我们在高正施加电位下观察到很少的阻塞(+200mV时,停留时间:0.2±0.1ms,事件间时间:为174.3±22.9ms),但在-50mV时没有观察到(图10C)。将pH 降至4.5导致捕获频率增加(停留时间:1.3±0.7ms,112.5±9.5事件s-1μM-1,图9B)。值得注意的是,ReFraC在酸性条件下负施加电位时经常显示微弱的门控事件,如图10C右下方所示。总之,两种纳米孔都可以捕获分子量相差 10倍的分析物(2.5kD相比25kDa)。

实施例6:FraC纳米孔的离子选择性和静电电位

为了更好地了解pH对静电环境的影响以及电渗流对多肽进入FraC纳米孔内的影响,我们使用了Adaptive Poission-Boltzmann Solver(APBS)(13)和PDB2PQR软件的修改版本(14)来估算1M KCl中pH7.5和4.5时WtFraC和 ReFraC的同源模型内的静电电位。模拟显示,WtFraC和ReFraC的纳米孔中心处的收缩区分别显示出极高的负电位和正电位(图11A)。有趣的是,尽管对于WtFraC而言,pH从7.5降低到4.5导致收缩中心的还原电位分别从 -1.2到-0.7kBT/ec(298K时,1kBT/ec=25.6mV),但对于ReFraC没有观察到这样的效应。

通过使用纳米孔任一侧的不对称KCl浓度(1960mM和467mM)测量两种孔的离子选择性,来估计电渗流对用WtFraC和ReFraC孔捕获分析物的贡献。然后使用反转电位(Vr),即电流为零的电位(图11B),与 Goldman-Hodgkin-Katz方程一起计算两种纳米孔的离子选择性

其中[ax]comp是顺式/反式隔室中离子X的活性,R是气体常数,T是温度,F是法拉第常数。我们发现FraC纳米孔的离子选择性受收缩区的电荷控制,其中WtFrac具有强阳离子选择性(pH 7.5)而 ReFraC具有阴离子选择性(pH 7.5)。将pH降至4.5降低了WtFraC的阳离子选择性((pH 7.5),然而这提高了 ReFraC的阴离子选择性(pH 4.5,图11B)。

实施例7:用WtFraC纳米孔检测生物标志物

在评估胰凝乳蛋白酶(25kD,245个氨基酸)和内皮素1(12.5kD,21个氨基酸)(其分别是胰腺囊肿(15)和闭塞性细支气管炎(16))的蛋白质生物标志物)的捕获后,使用WtFraC纳米孔检测更大范围的蛋白质生物标志物,包括外周动脉疾病生物标志物β2-微球蛋白(11.6kDa,99个氨基酸(17)),慢性肾病生物标志物人EGF(6.2kDa,53个氨基酸(18)),和高血压危象生物标志物血管紧张素I(1.3kD,10个氨基酸(19))。

在负施加电位下和pH4.5(除胰凝乳蛋白酶外)评估所有生物标志物。所有生物标志物的捕获频率随着施加电位而增加。所有其他测试参数显示出不均匀的电压依赖性。生物标志物在WtFraC内的停留时间增加(胰凝乳蛋白酶),降低(β2-微球蛋白和血管紧张素1)或表现出随着施加电位的双相行为 (EGF和内皮素1)参见图12。胰凝乳蛋白酶的剩余电流百分比(Ires%)的电压依赖性随电位降低,内皮素1的Ires%随电位增加,而β2-微球蛋白,EGF 和血管紧张素1的Ires%保持不变。尽管电流阻塞有复杂的电压依赖性,但我们的结果显示,WtFraC纳米孔能够仅通过其电流阻塞的Ires%来区分不同大小的寡肽和蛋白质生物标志物(图12)。

实施例8:近似同种型寡肽辨别

为了挑战我们的实验系统,我们寻求鉴别高度相似的分析物。我们选择内皮素1(ET-1)和内皮素2(ET-2),其为仅在21个氨基酸中有一个不同的近似异构的寡肽(图13A和13B)。-50mV时,我们观察到可辨别的阻塞,其中 ET-1(Ires%8.9±0.1%,停留时间5.6±2.0ms,N=3,n=600)和ET-2(6.1±1.4%,停留时间19.0±5.3ms,N=3,n=384)具有独特的Ires%和停留时间(图12B)。这使得它们已经能够在单个阻塞级别上进行鉴别(图13C)。

令人惊讶的是,当我们连续添加首先2μM ET-1(图13D),然后8μM ET-2 至同一孔中时(图13E),我们还可以通过绘制事件相对于其相应Ires%的振幅的标准差来分开两个不同群体的混合物。该观察结果表明,可以用FraC纳米孔辨别高度相似的(寡)肽或其他分析物。

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