用于肾病早期诊断的生物标志物SBP1及其用途的制作方法

文档序号:17930536发布日期:2019-06-15 00:48
用于肾病早期诊断的生物标志物SBP1及其用途的制作方法

本发明涉及用于肾病早期诊断的生物标志物及其用途,该生物标志物是硒结合蛋白1(SBP1)。更具体地,本发明涉及用于检测用于肾病早期诊断的生物标志物的组合物、包含该组合物的试剂盒、使用该试剂盒的动物试验方法和临床试验方法及其检测方法。



背景技术:

肾脏是一种排泄在体内代谢的并因此存在于血液中的各种物质的器官,特别是通过肾小球过滤和肾小管吸收和再吸收过滤血液,从而以尿液形式排出体内不必要的废物的器官。肾脏重量仅为体重的约0.5%,但流入肾脏的血液量为总心脏输出量的20%至25%。因此,由于血液中存在多种有毒的异生素,所以肾脏是最脆弱的器官之一。例如,当将过量的药物注入体内时,或者发生诸如心脏病、糖尿病和高血压等各种类型的代谢疾病时,肾脏可能非常缓慢地受损,并且最终停止肾功能而没有主观症状,例如有毒的异生素不会排泄到体外,从而导致额外的并发症。

特别是,由糖尿病和药物引起的急性/慢性肾病是临床实践中经常发生的病例。已知10-20%的肾功能急性恶化病例是由药物引起的,并且在经历器官移植如心脏移植的患者中也经常发生急性肾衰竭。目前,尽管在疾病诊断和治疗技术方面取得了快速进展,但对于重症监护病房(ICU)患者,急性肾衰竭死亡率在过去50年中仍然保持约50%而没有大幅增加,这仍然是一个需要克服的科学挑战。

此外,肾脏损害持续3个月或更长时间的病理现象称为慢性肾病(CKD),并且由于出现了老龄化社会和西方生活方式的传播,包括韩国在内的全球每年CKD发病率增加10%或更多。特别是,由于CKD是一种不可逆的疾病,在肾功能丧失60%或更多之前没有主观症状,但在此之后,在大多数患者中,CKD进展为终末期肾病(ESRD),意味着他们在没有透析的情况下不能过日常生活。此外,早期诊断CKD非常重要,因为它与心脑血管疾病等并发症的发生密切相关。CKD的患病率在全世界约为10%或更高,并且CKD是一种非常常见的疾病,像糖尿病或高血压。就韩国而言,据报道,CKD和ESRD已经增加,影响到十分之一的人。

虽然已知糖尿病(约70%或更多)是CKD的最主要病因,但由糖尿病肾病引起的ESRD进展的关键机理尚不清楚。最近,由于西方化的饮食习惯和衰老,糖尿病的发病率迅速提高,并且在全世界,随着糖尿病发病率提高,糖尿病慢性肾功能衰竭的发病率呈指数规律增长。

目前,在韩国,每10人中就有一人被认为患有糖尿病,而在60岁以上的老年人中,每10人中有2人患有糖尿病,每10人中另有2人患有糖耐量受损,这是糖尿病的前期-阶段。考虑到目前的趋势,预计糖尿病的发病率将在未来10到20年内爆发性增加。在美国,治疗糖尿病患者的医疗费用每年达到440亿美元,占单一疾病的最大部分,并且包括间接费用,每年可能造成980亿美元或更多的巨大经济损失。因此,预防由糖尿病引起的并发症的发生和发展是社会经济方面的一个非常重要的问题,例如减少医疗费用,以及降低患者的发病率和死亡率。

糖尿病由血管并发症并发,而不是疾病本身,并且作为糖尿病引起的血管并发症之一的糖尿病肾病是ESRD的首要病因。在韩国,据报道,糖尿病引起的ESRD患者的数量不断增加,并且糖尿病肾病占所有ESRD病因的47.1%。因此,根据这一趋势,预计由于糖尿病肾病的增加,ESRD患者的数量将增加,因此,担心患有肾病的患者由于透析、器官移植等而会降低生活质量以及增加经济负担。近年来,在美国,据报道糖尿病肾病的发病率增加了近两倍,造成巨大的医疗负担,因而糖尿病肾病已受到公众卫生的关注。

根据肾小球滤过率和蛋白尿将糖尿病肾病分为四个阶段,并且在糖尿病肾病的各阶段,可以看出微白蛋白尿先于肾小球滤过率的降低。此外,在第2阶段,糖尿病微白蛋白尿发生开始时,已经在肾脏中开始解剖学变化。然而,在微白蛋白尿的情况下,因为特异性低,对于诊断糖尿病肾衰竭是有限的。也就是说,在美国,在700万糖尿病肾病患者中,近200万患者没有微白蛋白尿,因此,使用微白蛋白尿诊断糖尿病肾病是有限的。

鉴于糖尿病肾病的稳定增加,目前使用的包括饮食、运动和药物治疗的一般治疗是不合适的,除了治疗糖尿病和糖尿病肾病的常规方法之外,还需要各种方法来治疗疾病。目前,为了预防糖尿病引起的肾病,已经使用了肾素-血管紧张素系统(RAS)抑制剂,但是用RAS抑制剂治疗减缓了慢性肾衰竭的进展,但是不能实现完全预防。因此,建立糖尿病肾病早期诊断和进展的新指标,并且确定糖尿病肾病的治疗效果势在必行。

目前已知的与糖尿病肾病进展相关的危险因素包括年龄增加,糖尿病病程延长、GFR快速下降、肾小球明显受损、HbA1c高、高脂血症(胆固醇、甘油三酯)、高血压、糖尿病神经病变的存在、糖尿病视网膜病变的存在、阳性家族史、体重或腰臀比增加以及吸烟,以及在管理这些危险因素的情况下,正在努力诊断糖尿病肾病。当诊断出糖尿病肾病时,定期对GFR进行年度监测对于评估肾功能损害的进展是重要的,同时,进行微白蛋白尿变化的跟踪。

临床上,由于GFR比微白蛋白尿的变化更准确地反映肾功能,因此GFR的变化是决定患者预后的重要因素。根据针对I型和II型糖尿病患者,特别是针对3期或更晚期的CDK患者进行的几项临床试验,初始治疗后尿蛋白水平降低被认为是反映肾脏预后的良好指标,但对于处于1期和2期(肾病的早期阶段)CDK患者而言,已知治疗后尿蛋白的早期减少不是肾脏的长期预后因素。

据估计,大多数糖尿病患者具有大量蛋白尿,但据报道,大约30%至40%的患者在没有微白蛋白尿的情况下肾功能恶化。根据最近对没有蛋白尿的肾功能恶化患者的患病率的研究,在II型糖尿病患者中,GFR低于60mL/min/1.73m2的患者的频率为23.1%,约高于正常人的1.3倍,并且55%的具有恶化的肾功能的糖尿病患者没有微白蛋白尿。

就糖尿病患者肾功能恶化而无微白蛋白尿的原因已经提出了几种假设。首先,估计没有微白蛋白尿的肾功能恶化是由于以下因素的组合导致的:由于大多数患者使用的RAS抑制剂的作用,通过使用血压调节药物对血压的调节和高脂血症药物的作用而导致蛋白尿丧失的可能性,糖尿病并发症主要发生在肾小管间质组织和伴随与糖尿病伴生的非糖尿病肾病的可能性,侵入入球微动脉的肾血管中的疾病和肾脏衰老过程的快速进展。然而,由于目前还没有关于没有微白蛋白尿的糖尿病肾病患者的病理生理机制的研究,因此需要对没有伴生蛋白尿的糖尿病性CKD的病理生理学和治疗进行更积极的研究,并且因为在诊断为糖尿病的患者中,在没有微白蛋白尿的情况下,肾功能可能会降低,因而有必要建立评估肾损伤的早期指标。

特别是,由于糖尿病性CKD,患者的医疗费用增加了1.8倍,而且当透析进展时,负担增加到10.3倍,导致由糖尿病和老龄化社会造成的巨大的医疗负担(Park et al.,2014)。截至2013年底,约有8万韩国人未接受肾脏替代疗法,无法过上健康的生活,这给个人和社会带来了沉重的负担。特别是,血液透析每周至少进行三次,透析费用非常高。例如,单疗程的透析费用至少为160,000韩元,每月需要大约2,500,000韩元或更高的医疗费用。90%的医疗费用由国民健康保险支付,因此需要巨额的政府医疗预算(每年1万亿韩元)。

由于没有特定的症状很难诊断CKD,并且疾病进展很长时间并且给生命带来风险,因此通过早期发现CKD和在适当的时间开始治疗来预防肾损伤的进展可能是预防CKD及其伴生的各种并发症的最有效方法。

同时,CKD的诊断通常通过评估肾功能来进行。也就是说,CKD是通过一般指标诊断的,例如使用血清肌酸酐和蛋白尿定量的GFR估计,但由于这些指标在肾损伤晚期后发生变化,因此在诊断后不可能正常修复受损的肾脏,并且作为最重要的指标的肌酸酐根据年龄、性别、肌肉量、甲状腺功能、饮食模式和药物而变化,因此作为精确测量和预测肾功能的因素具有局限性。

同时,由于已报道,急性肾损伤(AKI)与GFR降低和患者死亡率密切相关,因此通过开发评估肾损伤的指标来评估肾损伤的运动正在积极推进。对于由肾功能恶化引起的肾损伤末期反映的预先存在的肾功能指标(血清肌酸酐和BUN)的替代的研究正在增加。

国际上提出的新型肾损伤生物标志物包括肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和β2-微白蛋白,并且正在进行各种临床试验以检查KIM-1、NGAL、N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿非白蛋白蛋白(uNAP)和心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)可用作肾病的生物标志物。

对糖尿病患者进行的生物标志物相关研究表明,NGAL和GFR之间以及uNAP和白蛋白尿之间存在显著的关系,并且已经确定了这些新型生物标志物与肾损伤之间的关系。然而,大多数研究只有一小部分横向研究人群。因此,不能准确地反映新型生物标志物和糖尿病肾损伤的时间依赖性预测变化,并且已经评价现有生物标志物的诊断能力不优于微白蛋白尿。尽管对这些生物标志物的临床适用性的研究已经加速,但由于与疾病特异性肾损伤机制的相关性、对在临床样本中的预测能力的评估的缺乏等,它们尚未商业化。特别是,因为新的生物标志物尚未应用于糖尿病肾损伤,并且事实上,使用非特异性蛋白尿或微白蛋白尿和血清肌酸酐,因此早期诊断是困难的。

本发明人构建了具有糖尿病肾病的横向研究/随访患者组,以推断基于蛋白组的新型生物标志物并且评估临床适用性,此外,验证了新发现的肾损伤生物标志物的有效性和预测能力。通过比较新发现的肾损伤生物标志物和之前提出的肾损伤生物标志物,证实了验证效果的有效性。

在急性/慢性肾功能衰竭的情况下,症状发生后,应根据时间确定疾病的进展,因此早期诊断和早期治疗对于确定未来的生活预后非常重要,但还没有其诊断标志物。为了解决这个问题,最近已经开发并使用了各种类型的肾病生物标志物,但是应该使用血液中的所有生物标志物,并且通常在作为指标的血清肌酸酐(SCr)增加的情况下进行肾衰竭的诊断。然而,实际上,当肾功能障碍发生时,血清Cr在肾功能障碍的相当大的进展后增加,因此在诊断急性/慢性肾衰竭时,经常错过治疗肾功能障碍的最佳时机。因此,血清Cr不足以作为急性/慢性肾衰竭的诊断标志,并且必须使用尿发现早期生物标志物(参见未经审查的韩国专利申请公开号10-2010-0035637)。



技术实现要素:

技术问题

提出本发明以解决上述常规技术问题,并且本发明人试图开发一种具有比先前使用的用于确定肾病的标志物(例如血清Cr和血尿素氮(BUN))的灵敏度和特异性更高的用于早期诊断糖尿病肾病的方法,并确认使用利用抗体的技术测量根据疾病状况释放到尿液中的硒结合蛋白1(SBP1)的浓度,从而在肾功能衰竭的早期阶段以高特异性和灵敏度确定肾病。结果,完成了本发明。

因此,本发明涉及提供一种用于肾病早期诊断的组合物,其包括用于测量尿液中的SBP1的试剂。

本发明还涉及提供用于肾病早期诊断的试剂盒,其包括所述组合物。

本发明还涉及提供一种检测受试者的样品(尿液)中的SBP1以提供诊断肾病所需的信息的方法。

然而,本发明要解决的技术问题不限于上述问题,并且本领域普通技术人员根据以下描述将充分理解本文未描述的其他问题。

技术方案

在一个方面,本发明提供了用于评估肾病早期诊断的组合物,其包括用于测量SBP1的表达水平的试剂。

在本发明的一示例性实施方案中,SBP1可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

在本发明的另一示例性实施方案中,用于测量SBP1的表达水平的试剂可以是对尿液中的SBP1具有特异性的抗体。

在另一方面,本发明提供了一种用于肾病早期诊断的试剂盒,其包括所述组合物。

在本发明的又一示例性实施方案中,试剂盒可以是蛋白芯片试剂盒。

在另一方面,本发明提供了一种检测受试者样品中的SBP1以提供诊断肾病所需的信息的方法。

在本发明的又一示例性实施方案中,该方法可以进一步包括检测蛋白或编码该蛋白的mRNA,并将其表达水平与正常对照样品中的相应蛋白或编码该相应蛋白的mRNA的表达水平进行比较,并且检测蛋白可以通过使用对相应蛋白具有特异性的抗体进行的抗原-抗体反应进行的。

在本发明的另一示例性实施方案中,肾病可以是肾病综合征、肾癌、慢性肾衰竭、急性肾盂肾炎、急性肾衰竭、高血压肾病、瑞氏综合征(Reye’s syndrome)、痛风、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、白塞病(Bechet’s disease)、狼疮、念珠菌病(candidiasis)、肾病性出血热、钩端螺旋体病、军团病、常染色体显性遗传性多囊肾病或肾积水。

在本发明的另一示例性实施方案中,肾病可以是糖尿病肾病,并且在这种情况下,对于本领域技术人员显而易见的是,糖尿病肾病包括糖尿病性肾衰竭。

在另一方面,本发明提供了一种用于肾病早期诊断的方法,其包括:(a)从受试者获取尿液;(b)使用对所获取的所述尿液中的SBP1具有特异性的抗体检测SBP1;以及(c)在所述尿液中检测到SBP1时诊断为肾病。

在另一方面,本发明提供了用于测量尿液中的SBP1的表达水平的药剂用于肾病早期诊断的用途。

有益效果

由于根据本发明的尿SBP1和利用该尿SBP1的技术可以有效地用于糖尿病和药物引起的肾功能障碍的早期诊断以及疾病严重性的预测和评估,以高的灵敏度和特异性准确地确定由暴露于药物引起的肾功能障碍,并且通过相对简单的方法有效诊断肾脏的早期异常症状,因此,预期SBP1广泛应用于不同领域,例如用于临床治疗中常见的药源性急性肾功能衰竭的诊断,以及对于开发新药是必不可少的临床前毒性试验。

附图说明

图1A和1B显示了通过处理链脲佐菌素(STZ)建立类似于人的糖尿病动物模型的实验设计,图1C显示通过向糖尿病动物施用抗糖尿病药物来测量血糖浓度的结果,并且图1D显示了测量尿液中的微白蛋白的结果,其是糖尿病肾病的最重要因素之一,并且如图1C和1D所示,证实了在给大鼠施用STZ后,尿液中的微白蛋白浓度(其是由糖尿病引起的肾功能障碍的代表性指标之一)增加,并且实验动物模型被很好地呈现以预测糖尿病肾衰竭。

图2A和2B说明了检查抗糖尿病药物的效果的重要实验方法,并且图2A显示了葡萄糖耐量试验的结果,图2B显示了胰岛素敏化试验的结果。

图3A显示了测量尿量、BUN和肌酸酐水平以确认在施用STZ的糖尿病动物模型中是否发生肾衰竭的结果,并且图3B显示了通过苏木精和曙红(H&E)染色鉴定在STZ诱导的糖尿病动物模型中的肾脏的组织学损伤程度的结果。如图3A所示,证明了糖尿病动物的尿量增加,从而增加了肾毒性指标,如BUN和肌酸酐。此外,肾脏的组织病理学发现显示了在糖尿病动物中的肾脏的肾小球和肾小管中发生严重的细胞死亡,并且如图3B所示,可以看出在与对照类似的施用抗糖尿病药物的实验组中肾组织未被损伤。图3C显示了确认在糖尿病肾衰竭动物模型中的尿液中的SBP1是否增加的结果,从而显示糖尿病动物中SBP1和NGAL显著增加,并证明尿液中的SBP1由于糖尿病肾衰竭而非常灵敏地增加。

图4A显示了使用众所周知的作为II型糖尿病动物模型的Zucker糖尿病脂肪(ZDF)大鼠制造糖尿病模型的设计,图4B显示了在给ZDF大鼠喂食高脂肪饮食后每月测量血糖水平的结果,图4C显示了在给ZDF大鼠喂食高脂肪饮食5个月然后进行尸体解剖后使用H&E染色确认肾脏的组织学损伤程度的结果,并且图4D显示了根据在ZDF饮食和正常大鼠中的高脂肪饮食比较BUN水平的结果。图4E显示了在给ZDF大鼠喂食高脂肪饮食4周后测量尿液中的SBP1、NGAL、波形蛋白和KIM-1含量的结果。

图5显示了测量糖尿病患者尿液中的SBP1、Kim-1和NGAL的含量的结果。

图6示出了慢性高血糖(糖尿病)患者的肾功能如何恶化,并且显示了根据糖尿病的进展阶段检测到的指标(即,生物标志物)。

图7A显示了口服施用作为代表性肾毒性物质(0.1mg/kg、1mg/kg和5mg/kg)的重金属(汞、HgCl2)1个月后通过诱导肾功能的慢性恶化而获得的结果,以及通过H&E染色获得肾组织的病理学研究结果,图7B显示了通过处理作为肾毒性物质的重金属(汞,HgCl2)在肾组织中的SBP1的表达,以及图7C显示了在施用少量HgCl2(0.1mg/kg)一个月后组织学损伤的评估指数以及血尿素氮(BUN)和肌酸酐的水平。

图8A显示在施用抗癌剂顺铂(CDDP)(一种代表性的肾毒性物质)后第1天、第3天和第5天肾脏的组织学损伤,其通过肾组织中表达的SBP1的组织化学染色证实,图8B显示了对于未治疗对照和施用药物的实验组测量的异常肾功能的常规标志物,例如血清肌酸酐、BUN和尿SBP1水平,以及图8C显示了根据CDDP施用的肾和尿液中的SBP1水平,其通过蛋白印迹定量。

图9A显示了通过对施用了顺铂和四氯化碳(CCl4)的大鼠肝脏的H&E染色获得的组织病理学结果,图9B显示了在施用CCl4后随时间变化(例如在第1天、第3天和第5天)而确认AST和ALT水平(其为肝毒性指标)的结果,图9C显示了通过蛋白印迹的定量结果,以观察是否通过施用尿液中的肝毒性物质产生SBP1,并且图9D是根据施用的肝毒性物质确认作为肾毒性指标的BUN和肌酸酐水平的变化的结果。

图10A显示了作为诱导急性肾衰竭的测试模型的缺血性肾病(缺血/再灌注)模型的设计,并且图10B显示了缺血性肾衰竭的典型机理。

图11A显示了通过在诱导缺血性肾衰竭后9小时、24小时和48小时获得血液来评估肾毒性指标的结果,并且图11B显示了在缺血/再灌注模型和假手术(Sham)组(未进行手术的组)中比较尿SBP1和肾功能障碍的常规生物标志物的结果。

图12A显示了正常患者和肾衰竭患者中BUN和肌酸酐含量的比较,并且图12B显示了通过蛋白印迹测量尿液中的SBP1、NGAL、TIMP1和KIM-1的含量的结果。

图13显示了对入住ICU的20名患者测量尿液中的BUN、肌酸酐和SBP1的结果。

图14显示了接受者通过尿液中每种标志物对药物诱导的肾功能障碍操作特征曲线(ROC)-曲线下面积(AUC)参数分析的结果。

图15示出了迄今已知的用于诊断肾功能恶化的生物标志物的类型。

具体实施方式

发明人充分证明,根据示例性实施方案,由糖尿病引起的肾衰竭使用诱导糖尿病肾衰竭的动物模型诱导,然后证实在尿液中检测到SBP1,并且通过证明在施用抗糖尿病药后未检测到SBP1,完成本发明。此外,通过测量糖尿病患者尿液中的SBP1,证明尿液中的SBP1根据较长的糖尿病持续时间被显著地检测到,从而证明SBP1作为糖尿病肾衰竭的早期诊断标志物具有价值。

此外,在将顺铂(CDDP)(其是一种众所周知的即使在急性肾毒性模型中也引起肾功能障碍的药物)注射到大鼠体内后,确认在实验组和未经处理的对照组中在24小时获得的尿液中所含SBP水平或在尸体解剖后从大鼠收集的血清的变化。因此,完成了本发明。

在本发明的一示例性实施方案中,为了证实作为肾病的早期诊断生物标志物的SBP1的可用性,通过诱导由顺铂/HgCl2引起的肾功能障碍进行评估,显示在施用顺铂/HgCl2的实验组中,尿液中含有的血清肌酸酐(SCr)、BUN、葡萄糖,LDH,天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总蛋白水平升高(参见实施例2)。

因此,根据本发明的作为新型生物标志物的SBP1可用于各种目的和应用,其需要用于从尿液(而不是血液)快速、简单和早期预测或诊断由环境污染物或药物及其副作用引起的肾功能障碍的风险的技术。

在下文中,将详细描述本发明。

本发明提供了用于肾病早期诊断的组合物,其包括用于测量SBP1的表达水平的试剂,并且SBP1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1表示。

在本发明中,药物包括天然存在的导致个体的肾脏的功能障碍的所有物质。例如,药物可以是但不限于顺铂、4-氨基苯酚(PAP)、马兜铃酸、2-溴乙胺(BEA)、DCVC、镉、氯化镉、头孢哌酮、头孢噻吩、硝酸铈(cerium nitrate)、朱砂、环孢菌素、西罗莫司、多柔比星、肉苁蓉(herba cistanches)、六氯丁二烯、氢化可的松、庆大霉素、氯化锂、硝酸镧(lanthanum nitrate)、纳米铜、氯化汞、三聚氰胺、氰尿酸、赭曲霉毒素A、丙烯亚胺(propyleneimine)、嘌呤霉素、D-丝氨酸、铬酸钠、他克莫司(tacrolimus)、TCTFP、妥布霉素、硝酸铀或万古霉素。

在本发明中,重金属可以是但不限于汞(Hg)、镉(Cd)、铂(Pt)、铅(Pb)或铬(Cr)。

引起肾功能障碍的其他物质可包括但不限于卤代烃(例如,四氯化碳、氯仿等)、各种类型的环境污染物(2,4,5-三氯苯乙酸、除草剂百草枯、多氯联苯、2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英等)。

本文使用的术语“评估”是指确认病理状况的存在或特征。出于本发明的目的,评估可以意味着诊断、预测、检测或确认肾功能障碍的发生和可能性。

本文使用的术语“用于评估的标志物,待评估的标志物或评估标志物”是指能够将具有肾功能障碍或其可能性的细胞或组织与正常细胞或组织区分开的材料,并且包括有机生物分子,例如多肽或核酸(例如,mRNA等)、蛋白、脂质、糖脂、糖蛋白或糖(单糖、二糖、寡糖等),与正常细胞或组织相比,其在肾功能障碍细胞或组织中增加或减少。为了本发明的目的,本发明的肾功能评价标志物是SBP1,与正常肾组织的细胞相比,其在暴露于引起肾功能障碍的物质的组织的细胞中显示出特别高的表达水平,并且在暴露于引起肾功能障碍的物质的组织的细胞中显示出特别高的表达水平。

可以从已知的基因数据库容易地获得本发明提供的用于评估肾病的生物标志物的蛋白或基因的信息。例如,生物标志蛋白的氨基酸序列或编码该蛋白的mRNA的碱基序列记录在已知的基因数据库,即国家生物技术信息中心(NCBI)中。

本文使用的术语“用于测量蛋白表达水平的试剂”是能够通过确认生物标志物的表达水平用于检测标志物的分子,所述生物标志物的表达因如上所述的肾功能障碍而改变。

可以通过确认标志蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的mRNA的表达水平来确定相应生物标志物的表达水平。

本文使用的术语“蛋白表达水平的测量”是通过使用特异性结合相应标志蛋白的抗体检测抗原-抗体复合物确认受试者的生物样品中的肾功能障碍标志蛋白的存在和表达水平以评估肾功能(例如蛋白的量)的过程。具体分析方法的示例包括但不限于蛋白印迹,酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散、欧氏双向(Ouchterlony)免疫扩散、火箭(Rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS和蛋白芯片。

优选地,用于测量蛋白水平的试剂是抗体。

本文使用的术语“抗体”,作为本领域中使用的已知术语,是指针对抗原结构域的特定蛋白分子。为了本发明的目的,抗体是指特异性结合本发明的生物标志蛋白的抗体,并且这种抗体可以根据常规方法由标志基因编码的蛋白制备,所述标志基因根据常规方法克隆表达载体中的每个基因获得。这里,抗体还包括能够由蛋白制成的部分肽,并且本发明的部分肽包括至少7个氨基酸,优选9个氨基酸,更优选12个或更多个氨基酸。

本发明的抗体的类型没有特别限制,并且抗体包括所有免疫球蛋白抗体,以及多克隆抗体、单克隆抗体或其部分,只要其具有抗原结合能力即可。此外,本发明的抗体包括特异性抗体,例如人源化抗体。

用于检测本发明的用于评估肾功能的标志物的抗体包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式,以及抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段,并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。

本文使用的术语“mRNA表达水平的测量”是确认受试者的生物样品中编码肾功能障碍标志蛋白的基因的存在和表达程度以评估肾功能的过程,并且可以通过例如测量mRNA水平来确定。分析方法的具体示例可包括但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNA酶保护测定(RPA)、RNA印迹法(northern blotting)和DNA芯片。

用于测量mRNA表达水平的试剂可以是引物对、探针或反义寡核苷酸。由于本发明的生物标志物的核酸序列是已知的,因此本领域普通技术人员可基于序列设计特异性结合基因特定区域的引物、探针或反义寡核苷酸。

本文使用的术语“引物”是指具有游离3'羟基的短核酸序列,并且具体地,是与互补模板形成碱基对并且用作模板链复制的起始点的短核酸序列。引物可以在合适的温度下,在用于聚合反应的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的三磷酸核苷的存在下,在合适的缓冲液中启动DNA合成。优选地,在本发明中,使用特异性结合编码标志蛋白的mRNA的多核苷酸和有义和反义引物进行PCR扩增,从而通过产生所需产物来评估肾功能障碍。可以基于本领域已知的方法修饰PCR条件和有义和反义引物的长度。

本文使用的术语“探针”是指包括几个到几百个碱基的核酸(例如RNA或DNA)的片段,其可以实现与mRNA的特异性结合,并被标志,从而证实特异性mRNA的存在或不存在。探针可以以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针的形式制造。在本发明中,可以通过使用标志mRNA多核苷酸和互补探针的杂交来评估肾功能障碍。可以基于本领域已知的方法修改合适探针和杂交条件的选择。

本发明的引物或探针可以通过亚磷酰胺固体载体方法或其他广为人知的方法化学合成。另外,可以使用本领域已知的各种方法修饰这种核酸序列。此类修饰的非限制性示例包括甲基化、加帽(capping)、用天然核苷酸的一个或多个同源物取代和在核苷酸之间的修饰,例如,不带电荷的接头(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯或氨基甲酸酯)或带电荷的接头(例如,硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)。

本文使用的术语“反义寡核苷酸”是指基于核酸的分子,其具有与靶向生物标志基因的mRNA序列互补的序列,并且可以与标志基因的mRNA形成二聚体。

这里,互补结合意指充分互补结合,以在预定的杂交或退火条件下,并且优选地,在生理条件下,使反义寡核苷酸与RORC基因的mRNA靶选择性杂交,优选地,基本上互补结合和完全互补结合,并且更优选地,完全互补结合。

此外,本发明提供了用于诊断肾病的试剂盒,其包括用于测量SBP1或编码SBP1的mRNA的表达水平的试剂。

本发明的试剂盒可以通过确认用于评价肾功能的标志物的蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平来检测标志物。根据本发明的用于诊断肾病的试剂盒可以包括由一种或多种适合于分析方法的组分组成的组合物溶液或装置,以及选择性识别标志物以测量用于评估肾功能的标志物的表达水平的引物、探针或抗体。

作为具体示例,根据本发明的用于测量用于评估肾功能的标志蛋白的表达水平的试剂盒可包括底物、适当的缓冲液、用生色酶或荧光物质标志的二抗和用于免疫学检测抗体的显色底物。这里,底物可以是硝酸纤维素膜、由聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板和由玻璃制成的载玻片,生色酶可以是过氧化物酶或碱性磷酸酶。荧光材料可以是FITC或RITC,并且显色底物溶液可以是2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)。

作为另一具体示例,在本发明中,用于测量相应标志物的mRNA的表达水平的试剂盒可以是包括用于进行RT-PCR的必需组分的试剂盒。RT-PCR试剂盒可包括试管或不同的合适容器、反应缓冲液(各种pH和镁浓度)、脱氧核糖核苷酸(dNTP)、酶(如taq-聚合酶和逆转录酶)、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水和无菌水,以及标志基因特异性引物对,其由本领域普通技术人员设计。另外,RT-PCR试剂盒可包括对定量对照具有特异性的引物对。另外,本发明的试剂盒可以是用于检测用于评估肾功能的标志物的试剂盒,其包括DNA芯片所需的必需组分。DNA芯片试剂盒可以包括基片(substrate),与基因或其片段相对应的cDNA作为探针附着于该基片上,基片可以包括对应于定量对照基因或其片段的cDNA。

另外,本发明提供了检测受试者样品中的SBP1或编码SBP1的mRNA的方法,以提供诊断肾病所需的信息。

更具体地,可以在mRNA或蛋白水平检测基因表达,并且可以使用已知方法从生物样品中分离mRNA或蛋白。

本文使用的术语“受试者”是指在所有身体器官中,在自然界中存在的生物体中具有肾脏的动物,优选哺乳动物,更优选人。哺乳动物可包括啮齿动物(大鼠、小鼠等)、兔、马、牛、羊、狗、猫、猴和人,但是本发明的受试者的类型不限于上述示例。

本文使用的术语“受试者样品”包括例如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊髓液或尿液等样品,其中用于评估肾功能的标志蛋白或编码标志蛋白的mRNA的表达水平是不同的,但本发明不限于此。优选地,样品可以是肾组织或构成肾组织的细胞。

通过上述检测方法,可以通过将正常对照中的基因表达水平与怀疑患有肾病的受试者中的基因表达水平进行比较来确认或预测在怀疑患有肾病的患者中是否实际发生肾功能障碍。换句话说,当通过比较在怀疑患有肾功能障碍的受试者的细胞或组织的样品中测得的本发明的标志物的表达水平与在正常细胞或组织的样品中测得的本发明的标志物的表达水平,证实了来自怀疑患有肾功能障碍的受试者的细胞的样品中的本发明的标志物的表达水平显著高于来自正常细胞的样品中的本发明的标志物的表达水平,则该受试者可以预测为肾病患者。

用于检测标志蛋白的分析方法包括但不限于蛋白印迹、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS和蛋白芯片。通过上面列出的分析方法,可以将正常对照中的抗原-抗体复合物形成的量与怀疑患有肾病的受试者中抗原-抗体复合物形成的量进行比较,并且通过确定用于评估肾功能的标志基因的蛋白表达水平的显著增加,可以预测或确认实际上在怀疑患有肾病的受试者中是否发生肾病。

本文使用的术语“抗原-抗体复合物”是指用于评估肾功能的标志蛋白和其特异性抗体的复合物,并且可以通过检测标志的信号大小定量测量抗原-抗体复合物形成的量。

蛋白表达水平的测量优选使用ELISA。ELISA包括各种ELISA方法,例如使用识别附着于固体支持物的抗原的标记抗体的直接ELISA,使用识别在识别附着于固体支持物的抗原的抗体的复合物中的捕获的抗体的标记抗体的间接ELISA,使用识别在固体支持物附着的抗体和抗原的复合物中的抗原的另一种标记抗体的直接夹心ELISA,和使用识别抗体(该抗体识别在与附着于固体支持物的抗体-抗原复合物反应后的抗原)的标记的二抗的间接夹心ELISA。更优选地,蛋白表达水平可以通过夹心ELISA方法测量,其中抗体附着于固体支持物以与样品反应,然后通过附着识别抗原-抗体复合物的抗原的标记抗体对样品进行酶促着色,或标记的二抗附着于抗原-抗体复合物的抗原以酶促显色。通过确认用于评价肾功能的标志蛋白和抗体之间的复合物形成程度,可以确认肾功能障碍是否发生。

另外,优选地,使用针对用于评估肾功能的标志物的一种或多种抗体进行蛋白印迹法。例如,总蛋白从样品中分离出来,进行电泳以按大小分离蛋白,并转移到硝酸纤维素膜上以与抗体反应。可以通过使用使用标志抗体确认抗原-抗体复合物产生量的方法确认通过基因表达产生的蛋白的量来检测肾功能障碍。通过检查对照中标志基因的表达水平和肾功能障碍发生细胞中标志基因的表达水平的方法进行检测。mRNA或蛋白的水平可以表达为上述标志蛋白的绝对(例如,μg/ml)或相对(例如,信号的相对强度)差异。

另外,优选地,使用针对用于评估肾功能的标志物的一种或多种抗体进行免疫组织化学染色。例如,获得并固定正常肾组织或细胞的样品,以及怀疑患有肾功能障碍的受试者的细胞或组织的样品,然后通过本领域广泛已知的方法制备石蜡包埋的块。将每个块制成厚度为几微米的切片,将其附着于载玻片上,并且然后通过已知方法与选自所述抗体中的一种进行反应。然后,可以洗涤未反应的抗体并用上述检测标记之一进行标记,以确定在显微镜下标记抗体。

另外,优选地,使用蛋白芯片,其中针对用于评估肾功能的标志物的一种或多种抗体被布置在基片上的预定位置处并且以高密度固定。例如,根据使用蛋白芯片分析样品的方法,蛋白从样品中分离出来,与蛋白芯片杂交以形成抗原-抗体复合物,并检测,从而确认蛋白的存在或表达程度,以及肾功能障碍的发生。

作为检测标志物的mRNA的分析方法,可以使用逆转录酶-聚合酶链式反应、竞争性逆转录酶-聚合酶链式反应、实时逆转录酶-聚合酶链式反应、RNA酶保护测定、RNA印迹或DNA芯片测定。但是,本发明不限于此。通过检测方法,可以将正常对照中的mRNA表达水平与怀疑患有肾病的受试者中的mRNA表达水平进行比较,并且可以确定肾功能评估标志基因中的mRNA表达水平的显著提高/降低,从而评估在怀疑患有肾病的受试者中是否实际发生肾病。

mRNA表达水平的测量优选使用利用对用作评估肾功能的标志物的基因具有特异性的引物的逆转录酶-聚合酶链式反应或DNA芯片。在逆转录酶-聚合酶链式反应后,可以进行电泳以检查条带图案和条带厚度,从而确认mRNA表达及其用作用于评估肾功能的标志物的基因的程度,并通过比较该结果与对照的结果,可以简单地确认或预测肾病的发生。

同时,所述DNA芯片使用一种DNA芯片,在该DNA芯片中对应于用于评估肾功能的标志基因或其片段的核酸以高密度附着于诸如玻璃之类的基片上,并且从样品中分离mRNA,在其末端或内部用荧光材料标记的cDNA探针被制备并与DNA芯片杂交,然后可以确定肾病的发生。

通过上述检测方法,通过分析生物标志物的表达模式,可以准确且简单地确认或预测暴露于引起肾功能障碍的材料(例如重金属或药物)的患者中肾功能障碍的发生,并且基于此,它可用于治疗肾病和开发新药。

在本发明中,肾病可以是但不限于肾病综合征、肾癌、慢性肾衰竭、糖尿病肾病、糖尿病肾衰竭、急性肾盂肾炎、急性肾衰竭、高血压肾病、瑞氏综合征、痛风、干燥综合征、白塞病、狼疮、念珠菌病、肾病性出血热、钩端螺旋体病、军团病、常染色体显性遗传性多囊肾病或肾积水。

发明方式

在下文中,为了帮助理解本发明,将提出示例性实施例。然而,仅提供以下实施例以更容易理解本发明,而不是限制本发明。

[实施例]

实施例1.实验动物和方法

使用购自Charles River Laboratories(Orient,Seoul,Korea)的雄性SD大鼠(6周龄,雄性Sprague-Dawley大鼠)按照成均馆(Sungkyunkwan)大学的实验动物测试和研究伦理委员会的指导进行实验。

1-1.糖尿病动物模型的制备

在本发明的一个实施例中,制备施用STZ的糖尿病动物模型和使用Zucker糖尿病脂肪(ZDF)大鼠的糖尿病模型,作为糖尿病动物模型。

首先,作为施用STZ的糖尿病动物模型,将单剂量的STZ(50mg/kg)腹膜内(I.P.)施用给Sprague-Dawley大鼠(白色),每天测量血糖水平以评估血糖水平是否充分增加,从而证实了糖尿病的发生(增加约5倍),并且这里,一些实验组用抗糖尿病药物治疗4周,并且每周获得尿液以测量SBP1水平。

接下来,使用Zucker糖尿病脂肪(ZDF)大鼠作为糖尿病模型,ZDF大鼠是一种转基因动物,其中糖尿病从其出生时逐渐诱导,并广泛用作人II型糖尿病模型。特别地,已知ZDF大鼠在出生后8个月具有糖尿病,因此血糖水平逐渐升高,并且当喂食高脂肪饮食时,糖尿病迅速发展。在本发明中,通过向ZDF大鼠提供高脂肪饮食诱导糖尿病。

1-2.重金属诱导的慢性肾功能衰竭动物模型的制备

通过口服非常低剂量(0.1mg/kg)、低剂量(1mg/kg)和中等剂量(5mg/kg)的重金属持续30天来制备重金属(汞)诱导的肾衰竭动物模型,每天测量尿液量,测量最后一次给予实验物质后24小时所得尿液中所含蛋白的含量。另外,在收集血液后,对实验组和对照的大鼠进行尸检以定量血清和肾组织中含有的蛋白水平。

1-3.制备药物诱导的肾衰竭动物模型

将药物诱导的肾衰竭动物模型分为6只大鼠作为对照,6只大鼠作为实验组,白天,将已知是引起肾功能障碍的药物的顺铂(CDDP;浓度:10mg/kg,溶剂:生理盐水,I.P.)注射到大鼠体内。在注射后第1天、第3天和第5天,在施用顺铂的实验组和未处理的对照的大鼠中测量24小时获得的尿液中的蛋白含量。另外,在收集尿液后,对实验组和对照的大鼠进行尸检,并定量血清和肾组织中的蛋白水平。

1-4.电泳(SDS-PAGE)

使用缓冲液从尿液或组织中提取蛋白并将其定量,从而制备样品。将每个样品与SDS样品缓冲液混合,向其中加入蛋白酶或磷酸酶抑制剂,在95℃加热5分钟,然后进行电泳。

1-5.蛋白印迹

将提取的蛋白溶解,并转移到硝酸纤维素膜上。在此,将甲醇加入转移缓冲液中,并在80V下进行反应1小时。在转移蛋白后,用丽春红s(Ponceau S)对膜进行染色(在10秒至1分钟内,稍微染色以观察条带),并用DW或PBS充分洗涤以进行封闭。这里,将3至5%牛血清白蛋白(BSA)溶解在包含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS)的溶液中来制备使用的封闭缓冲液。将一抗在4℃下反应过夜,用洗涤缓冲液(含有表面活性剂的TBS或PBS)冲洗以除去未结合的一抗,然后使二抗反应。在二抗反应后,用洗涤缓冲液冲洗未结合的二抗,并使用鲁米诺(luminol)鉴定条带。

1-6.肾脏和肝脏的组织学发现(H&E染色)

在自溶之前从每个肾脏和肝脏中快速提取组织,然后用PBS或生理盐水除去组织周围的血液。在肾脏的情况下,去除外皮,并将右肾分成两半并包含在定影溶液(10%中性缓冲福尔马林)中,并且在肝脏的情况下,将包含最大叶的一部分切割后立即储存在定影液中。然后,以为组织体积的约10至20倍的体积加入定影液以固定肝脏部分约3天,并使用乙醇(70%->90%->95%->100%)脱水。除去醇后,将每个载玻片石蜡化至5μm的厚度,并用Mayer's苏木精和曙红(H&E;由DAKO制造)染色。然后,使用二甲苯对每个载玻片进行脱蜡,使用乙醇(100%->100%->95%->70%)除去组织中的二甲苯和水分。用自来水洗涤剩余的醇后,在室温下用苏木精染色载玻片30秒,洗涤剩余的苏木精,用曙红洗涤载玻片约1分钟,并洗涤剩余的曙红。使用乙醇(70%->95%->100%)除去组织中的水分,使用二甲苯除去乙醇,蒸发二甲苯,喷涂封固溶液,并将得到的载玻片盖上盖玻片并在室温下干燥。

1-7.肾组织中SBP1的免疫染色

在用二甲苯处理实施例1-6中制备的每个载玻片以除去石蜡后,使用乙醇(100%->100%->95%->70%)除去组织中的二甲苯和水分,用自来水洗涤载玻片,在微波炉中加热20分钟,用柠檬酸钠缓冲液对载玻片上的去皮组织进行抗原修复,用自来水冷却,在室温下浸入PBS中5分钟,然后用内源性过氧化物酶(甲醇:过氧化氢=3:1)处理以除去组织中不必要的抗原(室温下3至5分钟)。反应后,用PBS洗涤载玻片两次,持续5分钟,使用以正常山羊血清制备的封闭溶液封闭组织,在封闭溶液中稀释SBP1抗体,并在载玻片上铺板,使其在4℃下反应过夜。在反应后,将载玻片用洗涤液洗涤3次,持续5分钟,并附着二抗(室温下30分钟至1小时)。在反应后,将载玻片用洗涤液洗涤3次,持续5分钟,与抗生物素蛋白-生物素化的HRP反应30分钟,并用洗涤液洗涤3次,持续5分钟。然后,使洗过的载玻片与DAKO DAB溶液反应约1分钟,除去剩余的溶液,在室温下用苏木精溶液染色载玻片约30秒至1分钟,然后除去剩余的溶液。将载玻片用蓝色溶液(0.5%氢氧化铵)处理约30秒,除去剩余的溶液,并使用乙醇(乙醇70%->95%->100%)除去组织中的水分。随后,用二甲苯除去组织中的乙醇,在除去二甲苯后,用封固溶液处理载玻片,盖上盖玻片,然后在室温下脱水。

实施例2.糖尿病和肾衰竭动物模型的验证

2-1.具有施用STZ诱导的糖尿病的模型的验证

为了验证根据本发明的实施例1-1的由施用STZ诱导的糖尿病的动物模型,通过设计如图1A所述的实验模型进行实验.

结果,如图1B和1C所示,在对照中,显示了正常的血糖水平,但是在施用STZ的动物组中,与对照相比,血糖水平增加了约6倍或更高(600mg/dL或更高)。然而,在用抗糖尿病药物治疗糖尿病动物的实验组中,证实在第7天、第14天和第21天血糖水平逐渐降低,并且在最后一天(第28天)几乎降低至正常水平。另外,通过测量尿液中的作为糖尿病肾病的最重要因素之一的微白蛋白,可以证实,如图1D所示,在施用STZ的组中,与对照相比,尿液中的微白蛋白显著增加约10倍或更多,并且在施用抗糖尿病药物的实验组中,尿液中的微白蛋白降低至对照水平。

另外,为了确认抗糖尿病药的效果,进行葡萄糖耐量试验和胰岛素致敏试验。结果,如图2A和2B所示,可以证实,与糖尿病诱导的实验组相比,所有施用抗糖尿病药物的实验组都对血液中的葡萄糖敏感地响应。

然后,确认在通过施用STZ而诱导的糖尿病动物模型中是否发生肾功能衰竭。结果,如图3A所示,与对照相比,在糖尿病动物中,尿液体积(ml)增加3倍或更高(糖尿病的代表性临床症状之一),并且显示通过施用抗糖尿病药物,尿量减少,并且证实,与对照组相比,在施用STZ的组中,作为肾毒性的主要指标因子的BUN和肌酸酐增加约2倍或更高。可以看出,在施用抗糖尿病药物的组中,BUN和肌酸酐水平降低至正常范围。

根据以上结果,可以确认,在糖尿病动物模型中诱导了肾功能衰竭,而BUN和肌酸酐减少,因此在施用抗糖尿病药物的组中肾功能衰竭受到保护。

另外,为了确认糖尿病动物模型中肾脏的组织学损伤程度,将肾组织固定在10%中性福尔马林中,石蜡化,然后切成5μm的厚度。然后,将切片的组织脱蜡并用苏木精和曙红(H&E)染色。

结果,如图3B所示,证实在糖尿病动物模型中清楚地显示了肾小球和肾小管损伤,并且在施用抗糖尿病药物的实验组中显示了与正常组(对照)的组织学研究结果相似的组织学研究结果。

根据结果,可以估计当诱导糖尿病时,发生慢性肾衰竭。另外,如图3C所示,在糖尿病实验动物的尿液中检测到高水平的SBP1,并且通过施用抗糖尿病药物显著降低了检测到的SBP1。因此,结果表明SBP1可以作为糖尿病引起的肾衰竭早期诊断的指标。

2-2.Zucker糖尿病脂肪(ZDF)糖尿病模型的验证

如图4A所示,用ZDF大鼠进行实验,ZDF大鼠是根据本发明实施例1-1制备的Zucker糖尿病脂肪(ZDF)糖尿病模型,作为实验模型。更具体地,ZDF大鼠从出生后6个月开始喂食高脂肪饮食4个月,每个月获得每只大鼠的尿液以评估是否在尿液中检测到SBP1。

此外,在给ZDF大鼠喂食高脂肪饮食后,每个月测量血糖水平以检查是否诱导了糖尿病。

结果,如图4B所示,可以确认,在喂食高脂肪饮食的实验组中,根据时间将血糖浓度增加至600mg/dL或更高。

通过苏木精和曙红(H&E)染色证实了Zucker糖尿病脂肪(ZDF)糖尿病模型的肾脏的组织学损伤程度。

结果,如图4C所示,可以具体证实,肾脏的肾小球由于高脂肪饮食而受损,并且肾小管中的细胞损伤严重,并且如图4D所示,可以证实,与正常大鼠相比,高脂肪饮食ZDF大鼠中的BUN水平显著增加。另外,如图4E所示,当通过高脂肪饮食诱导高血糖时,证实尿液中的SBP1水平以时间依赖性方式逐渐增加。特别地,与作为常规肾毒性指标的NGAL和KIM-1相比,高脂肪饮食后两周,SBP1增加,从而证明SBP1在肾衰竭的早期诊断中非常灵敏。

2-3.糖尿病患者的验证研究

根据这些结果,为了研究上述结果是否与临床结果一致,从高丽大学医院提供糖尿病患者的尿样,并通过蛋白印迹检查是否在患者的尿液中检测到SBP1。

更具体地,通过对36名糖尿病患者测试尿SBP1,可以证实,在大多数患者中,检测到SPB1,并且特别地,随着糖尿病病程延长,患者的尿SBP1增加(参见图5)。

图6示出了显示了在II型糖尿病患者中SBP1是否通常排泄到尿液中的作用机理,表明由于高脂肪饮食导致肾脏中的氧化损伤增加,肾脏被各种类型的炎性因子的激活损坏,以及SBP1在肾细胞中高度表达,因此,首先证明,当肾近端小管细胞受损时,SBP1被释放到尿液中。

基于这些结果,图6示出了在糖尿病患者中引起肾衰竭的机理和用于通过步骤诊断肾衰竭的生物标志物的类型。可以证明,在糖尿病的早期阶段,SBP1排泄影响使用葡萄糖代谢的ATP合成的阶段,随着糖尿病的进展,发生对肾组织的氧化损伤,导致细胞因炎症而死亡。最后,可以看出肾功能通过诱导肾纤维化而受损。

实施例3.使用用于肾功能障碍的常规标志物的问题

根据本发明的该实施例,如临床所示,确认了II型糖尿病肾衰竭动物模型是否具有由于糖尿病而导致的肾衰竭。结果,证明糖尿病模型的所有两种类型(I型和II型)都具有肾功能障碍。因此,证实了作为诊断肾功能的标志物的BUN、肌酸酐和微白蛋白在糖尿病大鼠中被显著地检测到。

此外,在用于诊断肾功能障碍的常规试验中,通过测量代表性标志物来诊断顺铂/HgCl2引起的肾功能障碍,所述代表性标志物如尿液中含有的血清肌酸酐(SCr)、BUN和葡萄糖,LDH,天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总蛋白。

3-1.确认通过重金属(汞、HgCl2)诱导慢性肾功能障碍

随后,在口服施用(1mg/kg和5mg/kg)代表性肾毒性物质,即重金属(汞、HgCl2)一个月后,通过H&E染色获得肾组织的病理学研究结果。

结果,如图7A所示,证实通过长期施用低剂量(0.1mg/kg)汞诱导肾衰竭,因此,当口服施用低剂量的汞时,肾组织中的SBP1表达也增加。

另外,如图7B和7C所示,证实当施用非常小剂量(0.1mg/kg)的汞一个月时,尽管组织学损伤,并且BUN和肌酸酐水平没有增加,但在尿液中检测到SBP1。因此,估计,由于长期暴露于诸如重金属之类的有毒物质,在肾功能受损之前首先在尿液中检测到尿SBP1。

3-2.确认通过顺铂(CDDP)诱导肾功能障碍

如本发明的实施例1-2中所述,在向大鼠施用代表性肾毒性药物(顺铂;10mg/kg,I.P.)后,在第1、3和5天24小时使用代谢笼(用于代谢物分析的笼)收集尿液样品。通过将每个尿液样品以3000g离心15分钟获得上清液,并将其储存在-80℃的冰箱中。收集尿液后,用二氧化碳麻醉实验动物以从腹主动脉收集血液,并且在由于出血而自然死亡后,提取肾脏和肝脏。通过将每个血液样品以1500g离心15分钟获得上清液,并将其储存在-80℃的冰箱中。使用对应于每个参数的测试试剂盒对获得的尿液和血液样品进行常规标志物的检测。

结果,如图8A所示,在施用顺铂后第1天肾组织开始轻度受损,并且大多数肾小管在第5天严重受损,因此证明SBP1在肾组织的受损部分中被强烈染色。

根据该结果,如图8B所示,可以确认,在第1天,与对照组相比,在肾毒性指标(如血清肌酸酐和BUN)方面没有显著差异,但在施用CDDP后,与对照相比,指标在第3天显著增加,并且,在第5天增加约3至5倍或更多。

另外,如图8C所示,可以确认,通过蛋白印迹定量作为肾毒性指标的尿SBP1水平,证实在施用CDDP后第1天尿液中SBP1水平增加,并且在第5天检测到非常高的水平。

综合以上结果,可以确认SBP1比传统的肾毒性指标(如血清肌酸酐和BUN)更早地排泄到尿液中,并且可以推断,肾脏衰竭可以在不使用血液的情况下仅通过尿液容易地并且早期进行诊断。根据使用常规指标诊断分析给药引起的肾功能障碍,可以在一定程度上预测肾功能障碍,但是如本领域已知的,在肾组织被显著损坏之后才发生肾功能障碍,因此,由于肾功能障碍的标志物(BUN和肌酸酐)的灵敏性和特异性非常低而难以在早期灵敏地预测肾功能障碍。因此,当SBP1用作用于诊断肾病的指标,即用于诊断肾病的标志物时,可以看出由于其优异的灵敏度和特异性,可以在早期有效地诊断由药物诱导的肾功能障碍。

实施例4.肝毒性模型中尿SBP1水平的测量

为了确认在肝毒性模型中是否释放尿液中的SBP1,向大鼠施用如四氯化碳(CCl4)之类的肝毒性物质以诱导肝毒性,然后测量尿液中的SBP1水平。

结果,如图9A所示,通过对施用四氯化碳的大鼠的肝脏进行H&E染色获得的组织病理学研究结果表明,在施用顺铂的组中没有诱导肝毒性,但是在施用四氯化碳的组中在施用后一天观察到严重的肝功能衰竭,并且随着时间推移逐渐恢复。另外,如图9B所示,可以确认,与对照相比,在施用四氯化碳的组中,肝毒性指标(AST和ALT水平)在施用后1天增加,并且然后减少。

此外,通过蛋白印迹,如图9C所示,当施用肝毒性物质时,在尿液中未检测到SBP1,并且如图9D所示,可以确认肾毒性指标BUN和肌酸酐没有变化。

根据以上结果可以推断,SBP1在尿液中是肾毒性特异性检测到的。换句话说,可以看出SBP1具有与肾病相关的非常高的特异性。

实施例5.缺血/再灌注模型中尿SBP1水平的测量

5-1.缺血/再灌注模型的制备

首先,优选准确地显示用于切割的肾脏位置。切割应通过最小限度的剪切(而不是多次剪切)进行。这是因为当切割表面光滑时,以后容易缝合,并且减少时间。沿着切割线切割外皮,充分去除外皮和内皮之间的中间层,然后切开内皮。用镊子小心地取出肾脏。在这里,需要注意防止肾脏受损,并且当难以挑出肾脏时,将肾脏从脂肪层中拉出是有帮助的。几乎所有的外周脂肪层都被移除,以清楚地看到肾门(肾脏血管聚集的地方),并且通过用尼龙绳子制成几个结来紧紧地绑住肾门(the hillum of the kidney)。然后,通过切割结的上部来移除肾脏(参见图10A)。去除脂肪需要小心,因为过多的脂肪去除会导致血管出血。

因此,将接受手术的大鼠放入预先组装的代谢笼(用于代谢物分析的笼子)中,并且在手术后,如下表1所示,每次按组收集尿液。然后,将在代谢笼中收集的尿液以3000rpm离心10分钟以沉淀杂质,仅获得上清液并将其分配到预先命名的管中,然后储存在冰箱中。这里,缺血性肾病的典型机理如图10B所示。

表1

5-2.尿液中SBP1水平的测量

如图11A所示,在诱导缺血性肾衰竭后,在9小时、24小时和48小时收集血液样品以评价肾毒性,从而证实BUN和肌酸酐水平一直在增加。与假手术组(未进行手术的组)相比,比较了尿SBP1和常规肾功能障碍生物标志物,并且通过该比较,如图11B所示,通过蛋白印迹来量化释放到尿液中的SBP1,可以看出通过IR在尿液中检测到的SBP1显著增加。

上述结果表明,SBP1作为缺血性急性肾衰竭的尿诊断标志物可以表现出优异的灵敏度。

实施例6.急性肾衰竭患者的尿SBP1水平的测量

6-1.样品(尿液)的收集和分析方法

随后,分别测量在急性肾衰竭患者组(P1~P7)的尿样和正常组(C1~C5)的尿样中的SBP1水平。从急性肾功能衰竭患者获得的尿液样本由高丽大学医学院提供(IRB批准前的尿液样本)以用于实验,并且使用与上述蛋白特异性反应的抗体,根据实施例1-3分析尿液中的SBP1、KMI-1、NGAL和TIMP-1含量。

6-2.尿蛋白含量的测量

结果,如图12A所示,首先,测量急性肾衰竭患者和正常人中的BUN和肌酸酐水平,并且证实肾衰竭患者显示出这些肾毒性指标的水平提高。

另外,如图12B所示,证实急性肾衰竭患者的尿液中的SBP1显著地升高。

与动物试验结果一样,上述结果表明,也在临床样品中,在正常人中未检测到尿SBP1,而仅在肾衰竭患者中检测到。

此外,对入住ICU的20名患者测量了BUN、血肌酸酐和尿SBP1。

更具体地说,没有关于患者组中谁有肾功能衰竭的信息,并且据报道入住ICU的患者中约有50%或更多通常患有肾功能衰竭,因此本发明中评估了肾功能衰竭的发生率。

结果,如图13所示,在大多数患者中,在住院前检测到高肌酸酐水平,并且在住院后,一些患者显示出改善的效果。因此,在大约70%或更多的患者中高度检测到尿SBP1。特别是显示,在编号为262的患者中,检测到非常高的血肌酸酐水平和高水平的SBP1。

6-3.接收器操作特征曲线(ROC)-曲线下面积(AUC)分析

基于上述结果,为了确定使用SBP1诊断肾功能障碍的方法的灵敏度和特异性,根据常规方法对药物诱导的肾功能障碍的每种标志物进行ROC-AUC参数分析(ROC-AUC分析通常显示当AUC值为0.7或更大时,确定标志具有显著性,并且当AUC值接近1时,确定标志物是优异的)。

如图14所示,通过分析使用SBP1作为指标诊断临床样品中的肾功能障碍的方法,证实SBP1显示其自身是具有接近1的AUC值(0.98)的优异参数,并且本发明的SBP1与常规肾功能障碍标志物相比,对肾功能障碍表现出相当优异的灵敏度和特异性。

实施例7.尿液中肾病相关蛋白含量的测量

虽然KIM-1和NGAL在临床上已被用作尿液中的肾功能障碍生物标志物(参见图15),但由于这些生物标志物对于临床使用而言是昂贵的,因此它们不易使用。然而,许多研究人员使用KIM-1和NGAL作为检测肾衰竭的生物标志物。

因此,在本发明中,根据实施例1-3中描述的方法使用与蛋白特异性反应的抗体分析尿中的SBP1、KMI-1、NGAL和TIMP-1的含量。

更具体地,在通过施用STZ诱导糖尿病的动物模型中,当诱导肾毒性时,使用蛋白印迹(抗原-抗体反应)测量尿液中检测到的SBP1水平。同样地,使用蛋白印迹(抗原-抗体反应)测量由高脂肪饮食诱导的糖尿病动物模型(ZDF大鼠)中的SBP1水平。

结果,如图4E所示,可以确认在正常组中根本没有检测到SBP1,但是在给药后2个月SBP1以时间依赖性方式增加,并且这里,最近报道的肾衰竭的诊断生物标志物,例如NGAL和KIM-1,在给药后4个月增加。因此,可以看出,对于糖尿病性肾衰竭,SBP1具有比不同类型的诊断标志物更高的灵敏度,从而证明SBP1作为早期诊断生物标志物是优异的。

另外,如图8C所示,通过比较施用顺铂的实验组和未处理的对照组中的尿SBP1水平,与对照相比,在第3天肾功能障碍诱导的实验组中尿SBP1水平高度增加,并且特别地,从第3天(即给药后的第3天)开始,SBP1水平的这种增加显著。

综合以上结果,预计在正常尿液中检测不到SBP1,且肾小管细胞在肾功能障碍的早期阶段被破坏并在尿液中检测到,并且通常可以看出SBP1在早期当在肾细胞中诱导对组织的氧化损伤时作为预防机制而增加,并且细胞被破坏时,SBP1释放到细胞外并且当氧化损伤严重时排泄到尿液中。当SBP1用作诊断肾病的指标,即尿标志物时,可看出由于优异的灵敏度和特异性,药物诱导的肾功能障碍可在其早期被非常快速、简单和有效地诊断。

本领域普通技术人员应该理解,本发明的上述描述是示例性的,并且在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下,可以容易地将本文公开的示例性实施方案修改为其他特定形式。因此,上述示例性实施方案应被解释为说明性的并且不受限于任何方面。

工业适用性

本发明涉及能够通过测量尿液中的SBP1表达水平早期诊断肾病的技术,并且由于根据本发明的肾病的早期诊断方法是简单的,并且具有高灵敏度和特异性,SBP 1可广泛用于各种领域,例如用于临床治疗中经常发生的药物引起的急性肾衰竭的诊断,以及对于开发新药必不可少的临床前毒性试验。

<110> 塞尔简泰克有限公司

<120> 用于肾病早期诊断的生物标志物SBP1及其用途(BIOMARKER SBP1 FOR EARLY DIAGNOSIS OF RENAL DISEASES, AND USE THEREOF)

<130> MPO19-019CN

<150> KR 10-2016-0109119

<151> 2016-08-26

<150> KR 10/2017/0061144

<151> 2017-05-17

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 664

<212> PRT

<213> 硒结合蛋白1(Selenium-Binding Protein 1)

<400> 1

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1 5 10 15

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