转录因子NtERF241及其使用方法与流程

文档序号:17930488发布日期:2019-06-15 00:48

本申请要求2016年9月2日提交的美国临时专利申请号62/382,895的优先权,其内容在此通过引用以其全部被并入。

技术领域

本技术一般涉及用于修饰植物代谢的转录因子,编码这种转录因子的核酸分子,以及使用这些核酸调节植物中生物碱产生和用于产生具有改变的生物碱含量的植物和植物细胞的方法。



背景技术:

提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或引用的参考文献均未被承认是现有技术。

植物天然产物长期以来被用于增强人类健康和社会生活。这些生物活性天然植物产物之一是生物碱,其包含一类含氮次级代谢物。生物碱的实例包括吗啡、莨菪碱、喜树碱、可卡因和烟碱。烟碱,一种吡咯烷生物碱,是在烟草属物种中产生的最丰富的生物碱之一,并在根中合成,然后通过植物维管系统转运到叶子和其他空中组织,在那里它充当防御食草动物的防御性化合物。来自前体聚胺腐胺的烟碱产生可以通过植物中的两个途径完成。腐胺可以分别通过脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)或精氨酸脱羧酶(ADC)的活性直接从鸟氨酸或精氨酸合成。烟碱生物合成的第一关键步骤是通过腐胺N-甲基转移酶(PMT)将腐胺转化为N-甲基腐胺。随后将N-甲基腐胺通过二胺氧化酶(DAO)氧化,并环化以产生1-甲基-Δ1-吡咯(pyrrolium)阳离子,其随后与烟酸缩合产生烟碱。

在转录水平下基因表达的调节是许多生物过程中的主要控制点,包括植物代谢和烟碱生物合成。因此,需要鉴定烟碱生物合成途径的其他调节剂以及用于基因调节植物中烟碱和其他生物碱的生产水平的组合物和改进方法,包括转基因植物、转基因烟草植物、重组稳定细胞系、重组稳定烟草细胞系及其衍生物。



技术实现要素:

本文公开了用于调节植物中的生物碱生物合成的方法和组合物。

在一个方面,本公开提供了分离的cDNA分子,其包括选自下列的核苷酸序列:(a)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(b)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(c)与(a)或(b)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列,其中该核苷酸序列可操作地连接至异源核酸。

在另一方面,本公开提供了包括分离的cDNA分子的表达载体,所述分离的cDNA分子包含选自下列的核苷酸序列:(a)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(b)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(c)与(a)或(b)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列,其中该核苷酸序列可操作地连接至适合于在烟草属宿主细胞中定向表达(directing expression)的一种或多种控制序列。

在另一方面,本公开提供了包括含有嵌合核酸构建体的细胞的基因工程化产烟碱生物碱的烟草属植物,所述嵌合核酸构建体包括含有选自下列的核苷酸序列的分离的cDNA分子:(a)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(b)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(c)与(a)或(b)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列,其中该核苷酸序列可操作地连接至异源核酸。

在一些实施方式中,工程化烟草属植物是烟草属烟草植物。

在一些实施方式中,本公开提供来自基因工程化烟草属植物的种子,其中所述种子包括嵌合核酸构建体。

在一些实施方式中,本公开提供烟草产物,其包括基因工程化烟草属植物或其部分。

在一些实施方式中,分离的cDNA分子包括在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列。

在一些实施方式中,分离的cDNA分子包括编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

在一些实施方式中,分离的cDNA分子包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列。

在一些实施方式中,分离的cDNA分子包括与编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列。

在一个方面,本公开提供了用于增加烟草属植物中烟碱生物碱的方法,包括:(a)向烟草属植物中引入表达载体,所述表达载体包含选自下列的核苷酸序列:(i)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(ii)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列;和(b)在允许由核苷酸序列表达正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的条件下使植物生长;其中与在相似条件下生长的对照植物相比,转录因子的表达导致植物具有增加的烟碱生物碱含量。

在一些实施方式中,该方法还包括在烟草属植物中过表达NBB1、A622、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)或N-甲基腐胺氧化酶(MPO)中的至少一种。

在一些实施方式中,该方法还包括在烟草属植物中过表达至少一种正调节烟碱生物碱生物合成的另外的转录因子。在一些实施方式中,正调节烟碱生物碱生物合成的另外的转录因子是NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b中的至少一种。

在该方法的一些实施方式中,表达载体包括在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列。

在该方法的一些实施方式中,表达载体包括编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

在该方法的一些实施方式中,表达载体包括如下核苷酸序列:(a)其与(i)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;或(ii)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少约90%同一,和(b)其编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子。

在该方法的一些实施方式中,提供了基因工程化烟草属植物,其中与对照植物相比,所述植物具有正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的增加表达和增加的生物碱含量。

在该方法的一些实施方式中,提供了包括工程化植物或其部分的产物,其中该产物与从对照植物产生的产物相比具有增加的烟碱生物碱含量。在该方法的一些实施方式中,提供了来自基因工程化植物的种子。

在一个方面,本公开提供了用于减少烟草属植物中的烟碱生物碱的方法,其包括下调正调节生物碱生物合成的转录因子,其中所述转录因子通过以下方式下调:(a)向烟草属植物细胞引入包含cDNA分子的至少约15个连续核苷酸的核酸,所述cDNA分子包含选自下列的核苷酸序列:(i)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(ii)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列;其中连续核苷酸处于有义方向、反义方向或两者;(b)生产包含植物细胞的植物;和(c)与在相似条件下生长的对照植物相比,在核苷酸序列降低植物中转录因子水平的条件下使植物生长。

在一些实施方式中,该方法还包括在植物中抑制NBB1、A622、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、腐胺-N-甲基转移酶(PMT)或N-甲基腐胺氧化酶(MPO)中的至少一种。

在一个方面,本公开提供了用于减少烟草属植物中的烟碱生物碱的方法,其包括下调正调节生物碱生物合成的转录因子,其中所述转录因子通过以下方式下调:(a)向植物细胞群引入用于定向诱变包含cDNA分子的至少约15个连续核苷酸的靶标的试剂,所述cDNA分子包含选自下列的核苷酸序列:(i)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(ii)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列;和(b)检测和选择靶突变植物细胞或源自这种细胞的植物,其中与对照植物相比,靶突变植物细胞或植物在编码正调节生物碱生物合成的转录因子的基因中具有突变和具有降低的生物碱含量。

在该方法的一些实施方式中,试剂是促重组寡核苷碱基(recombinagenic oligonucleobase)。在一些实施方式中,试剂是靶向核酸酶。

在该方法的一些实施方式中,提供了突变植物,其中该植物与对照植物相比具有正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的降低表达和降低的生物碱含量。

在该方法的一些实施方式中,提供了包括突变植物或其部分的产物,其中该产物与由对照植物产生的产物相比具有降低水平的烟碱生物碱。在该方法的一些实施方式中,提供来自突变植物的种子。

在一个方面,本公开提供了用于降低烟草属植物群体中烟碱生物碱水平的方法,包括:(a)提供突变烟草属植物群体;(b)检测和选择群体内的靶突变植物,其中(i)与对照植物相比,靶突变植物具有正调节生物碱生物合成的转录因子的降低表达,(ii)检测包括使用cDNA分子作为引物或探针,和(iii)cDNA分子包含选自下列的核苷酸序列:(1)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(2)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(3)与(1)或(2)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列;和(c)与对照植物群体相比,选择性地繁殖靶突变植物以产生具有正调节生物碱生物合成的转录因子的降低表达的植物群体。

在该方法的一些实施方式中,提供了突变的产生物碱的烟草属植物,其中该植物与对照植物相比具有正调节生物碱生物合成的转录因子的降低表达和降低的生物碱含量。

在一些实施方式中,突变植物是烟草属烟草植物。

在一些实施方式中,提供了包括突变植物或其部分的烟草产物,其中该产物与由对照植物产生的产物相比具有降低水平的烟碱生物碱。在该方法的一些实施方式中,提供来自突变植物的种子。

在一个方面,本公开提供了过表达由SEQ ID NO:2编码的基因产物的基因工程化烟草植物,其中与对照相比,基因工程化植物表现出基因产物的增加表达,并且基因工程化植物包括细胞,所述细胞包括以5'至3'方向含有下列的核酸构建体:(a)在植物细胞中可操作的启动子,和(b)与启动子可操作地相关联的异源核苷酸序列,其中异源核苷酸序列包括在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列。

在一些实施方式中,提供基因工程化植物的后代,其中该后代具有由SEQ ID NO:2编码的基因产物的过表达。

在一个方面,本公开提供了制备基因工程化的增加烟碱的烟草细胞的方法,所述烟草细胞具有由SEQ ID NO:2编码的基因产物的过表达,该方法包括向细胞中引入包含选自以下的核苷酸序列的分离的cDNA分子:(a)在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列;(b)编码具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和(c)与(a)或(b)的核苷酸序列至少约90%同一并且编码正调节烟碱生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列可操作地连接至异源核酸,以基因工程化由SEQ ID NO:2编码的基因产物的过表达。在一些实施方式中,提供了通过该方法产生的烟草植物细胞。

在一些实施方式中,该方法还包括在烟草细胞内基因工程化至少一种正调节烟碱生物碱生物合成的另外的转录因子的过表达。在一些实施方式中,正调节烟碱生物碱生物合成的另外的转录因子是NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b中的至少一种。

在一些实施方式中,该方法还包括在烟草细胞内基因工程化选自NBB1、A622、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、腐胺-N-甲基转移酶(PMT)或N-甲基腐胺氧化酶(MPO)的一种或多种烟碱生物碱生物合成酶的过表达。

本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方式,包括但不限于本发明内容中阐述或描述或引用的那些。其并非旨在包括所有内容,并且本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中标识的特征或实施方式或被其限制,其仅出于说明的目的而不是限制的目的。可以在下面的具体实施方式中公开另外的实施方式。

具体实施方式

I.介绍

本技术涉及基因NtERF241的发现,该基因被预测编码调节烟碱生物碱生物合成途径的转录因子。已经确定了该基因的核酸序列。NtERF241的全长序列,包括编码区及其5'和3'上游和下游调节序列,在SEQ ID NO:1中列出。SEQ ID NO:1的开放阅读框(ORF),在SEQ ID NO:2中列出,被预测编码在SEQ ID NO:3列出的多肽序列。

乙烯响应元件结合因子(ERF)是植物特异性转录因子家族的成员。被称为ERF结构域的高度保守的DNA结合结构域是该蛋白质家族的独特特征。几种已知的ERF表现GCC盒特异性结合活性,并已显示调节植物中的转录。例如,ERF转录因子,包括NtERF1、NtERF32和NtERF121,已显示特异性结合NtPMT1a(编码腐胺N-甲基转移酶(PMT)的N.tabacum(普通烟草)基因之一)的茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的转录所需的GAG基序的GCC盒状元件——合成烟碱吡咯烷环的第一关键步骤。Sears等人,Plant Mol.Biol.,84:49-66(2014)。PMT启动子的GAG基序赋予ERF和Myc转录因子的募集。体外和体内研究表明,NtERF32作为NtPMT基因的转录激活因子起作用。NtERF32的过表达已显示NtPMT1a的体内表达和总生物碱含量增加,而RNAi介导的NtERF32敲低降低了烟碱生物合成途径中几种基因的mRNA水平,包括NtPMT1a和喹啉磷酸核糖转移酶(NtQPT2),并降低烟碱和总生物碱水平。Sears等人(2014)。在DNA水平下,NtERF32和先前未知的基因NtERF241大约90%同一。因此,预测NtERF241编码ERF转录因子,其正调节参与烟草生物碱生物合成的基因。

因此,在一些实施方式中,本技术提供了先前未发现的基因(NtERF241)或其生物活性片段,其可用于基因操作天然产生生物碱的植物中生物碱(例如,烟碱生物碱)的合成。例如,烟草属物种(例如,普通烟草(N.tabacum)、黄花烟草(N.rustica)和本氏烟草(N.benthamiana))天然产生烟碱生物碱。普通烟草(N.tabacum)是一种农作物,且该植物的生物技术用途继续增加。NtERF241基因或其生物活性片段可用于植物或植物细胞中以增加烟碱生物碱和相关化合物的合成,其可具有治疗应用。在一些实施方式中,本技术提供了通过基因工程化NtERF241的过表达来增加植物和植物细胞中烟碱生物碱产生的方法。在一些实施方式中,本技术提供了通过基因工程化NtERF241和至少一种选自NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b的MYC转录因子基因的过表达来增加植物和植物细胞中烟碱生物碱产生的方法。在SEQ ID NO:4中列出的NtMYC1a基因的开放阅读框(ORF)编码在SEQ ID NO:5中列出的多肽序列。在SEQ ID NO:6中列出的NtMYC1b基因的ORF编码在SEQ ID NO:7中列出的多肽序列。NtMYC2a基因的全长序列在SEQ ID NO:8中列出。NtMYC2a多肽序列在SEQ ID NO:9中列出。NtMYC2b基因的全长序列在SEQ ID NO:10中列出。NtMYC2b多肽序列在SEQ ID NO:11中列出。在一些实施方式中,通过NtERF241和至少一种选自NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b的MYC转录因子基因的组合过表达产生对烟碱生物碱产生的协同效应。NtERF241或其生物活性片段也可用于基因工程化烟碱生物碱合成的抑制,以产生含有零或低烟碱水平的烟草品种,用作生产植物制药(例如重组蛋白质和抗体)的低毒性生产平台,或用作工业、食品和生物质作物。

II.定义

本说明书中使用的所有技术术语在生物化学、分子生物学和农业中通常使用;因此,本技术所属领域的技术人员可以理解它们。那些技术术语可以在例如以下中发现:Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook and Russel(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001);Current Protocols In Molecular Biology,ed.Ausubel等人(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,New York,1988)(包括定期更新);Short Protocols In Molecular Biology:A Compendium Of Methods From Current Protocols In Molecular Biology 5th ed.,vol.1-2,ed.Ausubel等人(John Wiley&Sons,Inc.,2002);Genome Analysis:A Laboratory Manual,vol.1-2,ed.Green等人(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997)。涉及植物生物学技术的方法在此处描述,并且也在论文比如Methods In Plant Molecular Biology:A Laboratory Course Manual,ed.Maliga等人(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995)中详细描述。

“生物碱”是在植物中发现并通过二次代谢产生的含氮碱性化合物。“吡咯烷生物碱”是含有吡咯烷环作为其分子结构的一部分的生物碱,例如烟碱。烟碱和相关生物碱在公开文献中也称为吡啶生物碱。“吡啶生物碱”是含有吡啶环作为其分子结构一部分的生物碱,例如烟碱。“烟碱生物碱”是烟碱或与烟碱结构相关的生物碱,其由在烟碱生物合成途径中产生的化合物合成。示例性的烟碱生物碱包括但不限于烟碱、去甲烟碱、新烟草碱、新烟碱、新烟草灵、N-甲基新烟草碱、N-甲基新烟碱、麦斯明烟草碱、假木贼因、甲酰基去甲烟碱、尼可他因和可替宁。例如在Hecht等人,Accounts of Chemical Research 12:92-98(1979);Tso,T.G.,Production,Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant.Ideals Inc.,Beltsville,MO(1990)中报道了烟草叶子中其他非常少量的烟碱生物碱。

如本文所用,“生物碱含量”是指植物中发现的生物碱的总量,例如,以pg/g干重(DW)或ng/mg鲜重(FW)计。“烟碱含量”是指植物中发现的烟碱总量,例如,以mg/g DW或FW计。

“嵌合核酸”包含与核苷酸序列连接的编码序列或其片段,所述核苷酸序列不同于天然存在编码序列的细胞中与其相关的核苷酸序列。

术语“编码(encoding)”和“编码(coding)”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程,从该细胞可以将一系列氨基酸组装成特定的氨基酸序列以产生活性酶。由于遗传密码的简并性,DNA序列中的某些碱基变化不会改变蛋白质的氨基酸序列。

“内源核酸”或“内源序列”对于待基因工程化的植物或生物体是“天然的”,即固有的。它是指存在于待基因工程化的植物或生物体的基因组中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。

“外源核酸”是指通过人类的努力引入细胞(或细胞的祖先)的核酸、DNA或RNA。这种外源核酸可以是在其所引入的细胞中天然发现的序列的拷贝,或其片段。

如本文所用,“表达”表示通过基因的转录或由核苷酸序列编码的多肽产物的产生来产生RNA产物。“过表达”或“上调”用于表示相对于对照细胞或植物,通过基因工程化增加了细胞或植物中特定基因序列或其变体的表达,包括其衍生的所有后代植物(例如,“NtERF241过表达”)。

“基因工程化”包括用于将核酸或特定突变引入宿主生物体的任何方法。例如,当用抑制基因表达的多核苷酸序列转化植物时,对植物进行基因工程化,使得与对照植物相比,靶基因的表达降低。当引入导致植物中新基因的表达或植物中天然存在的基因产物水平的增加的多核苷酸序列时,对植物进行基因工程化。在本发明的上下文中,“基因工程化”包括转基因植物和植物细胞,以及通过例如通过使用嵌合RNA/DNA寡核苷酸(如由Beetham等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:8774-8778(1999)and Zhu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S;A.96:8768-8773(1999)描述的),或如在国际专利公布WO 2003/013226中描述的所谓的“促重组寡核苷碱基”实现的靶向诱变的方式产生的植物和植物细胞。同样地,可以通过引入经修饰的病毒来产生基因工程化的植物或植物细胞,其又在宿主中引起基因修饰,其结果类似于在转基因植物中产生的结果。参见,例如,美国专利号4,407,956。另外,基因工程化的植物或植物细胞可以是任何天然方法的产物(即,不涉及外源核苷酸序列),通过仅引入源自宿主植物物种或性相容的植物物种的核酸序列实施。参见,例如,美国专利申请号2004/0107455。

“异源核酸”是指核酸、DNA或RNA,其已被引入细胞(或细胞的祖先),并且不是天然存在于其所引入的细胞中的序列的拷贝。这种异源核酸可以包含区段(segment),所述区段是天然存在于其所引入的细胞中的序列的拷贝,或其片段。

“分离的核酸分子”是指已从其天然环境中除去的核酸分子、DNA或RNA。例如,出于本技术的目的,认为DNA构建体中包含的重组DNA分子是分离的。分离的DNA分子的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中部分或基本纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本技术的DNA分子的体外RNA转录物。根据本技术,分离的核酸分子还包括合成产生的这种分子。

“植物”是包括完整植物、植物器官(例如,叶、茎、根等)、种子、分化或未分化的植物细胞及其后代的术语。植物材料包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、茎、果实、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“植物细胞培养物”是指植物单元的培养物,例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵和处于不同发育阶段的胚。在本技术的一些实施方式中,提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物,其中转基因组织或细胞培养物包含本技术的核酸分子。

“减少生物碱的植物”或“降低生物碱的植物”包括基因工程化植物,其中生物碱含量减少至相同物种或品种的对照植物的生物碱含量的低于50%,优选地低于10%、5%或1%的水平。

“增加生物碱的植物”包括基因工程化植物,其生物碱含量的增加大于相同物种或品种的对照植物的生物碱含量的10%,并且优选地大于50%、100%或200%。

“启动子”意指转录起始上游的DNA区,其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。“组成型启动子”是在植物的整个寿命期间和在大多数环境条件下具有活性的启动子。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成一类“非组成型启动子”。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接,其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常,“可操作地连接”意指连接的核酸序列是连续的。

在两个多核苷酸(核酸)或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括提及当在特定区内对齐以获得最大对应性时,两个序列中的残基是相同的。当使用序列同一性百分比提及蛋白质时,认识到不相同的残基位置的差异通常在于保守氨基酸置换,其中氨基酸残基被其他具有类似化学性质(比如电荷和疏水性)的氨基酸残基置换,并且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守置换方面不同时,可以向上调整序列同一性百分比以校正置换的保守性质。据说通过这种保守置换而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。通常,这涉及将保守置换评分为部分而非完全错配,从而增加序列同一性百分比。因此,例如,当给予相同的氨基酸得分为1并且给予非保守置换得分为零时,保守置换被给予0和1之间的得分。例如根据Meyers&Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)的算法,计算保守置换的得分,在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中实施的。

在本说明书中使用序列同一性百分比表示通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的值,其中比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即,缺口)。通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算百分比,以产生匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。

术语“抑制”或“下调”同义使用以表示相对于对照细胞或植物,通过基因工程化降低了细胞或植物中特定基因序列或其变体的表达,包括其衍生的所有后代植物(例如,“NtERF241下调”)。

如本文所用,“协同效应”是指通过至少两种化合物的组合产生的大于加和的效应(例如,由至少两种转录因子的组合过表达产生的效应,例如NtERF241和优选地选自NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b的至少一种MYC转录因子基因),并且其超过了以其他方式由单个化合物产生的那些(例如,由单个转录因子比如单独的NtERF241的过表达产生的效应)。

“烟草”或“烟草植物”指的是产生烟碱生物碱的烟草属中的任何物种,包括但不限于下列:无茎烟草(Nicotiana acaulis)、Nicotiana acuminata、Nicotiana acuminata var.multzjlora、非洲烟草(Nicotiana africana)、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana amplexicaulis、Nicotiana arentsii、Nicotiana attenuata、贝纳末特氏烟草(Nicotiana benavidesii)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、毕格罗夫烟草(Nicotiana bigelovii)、博内里烟草(Nicotiana bonariensis)、Nicotiana cavicola、克利夫兰烟草(Nicotiana clevelandii)、心叶烟草(Nicotiana cordifolia)、伞床烟草(Nicotiana corymbosa)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)、Nicotiana excelsior、福尔吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)、香烟草(Nicotiana fragrans)、粉蓝烟草(Nicotiana glauca)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、Nicotiana goodspeedii、Nicotiana gossei、杂交烟草(Nicotiana hybrid)、Nicotiana ingulba、川崎烟草(Nicotiana kawakamii)、奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)、朗氏烟草(Nicotiana langsdorfi)、狭叶烟草(Nicotiana linearis)、长花烟草(Nicotiana longiflora)、Nicotiana maritima、Nicotiana megalosiphon、摩西氏烟草(Nicotiana miersii)、夜花烟草(Nicotiana noctiflora)、裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)、欧布特斯烟草(Nicotiana obtusifolia)、西方烟(Nicotiana occidentalis)、Nicotiana occidentalis subsp.hesperis、Nicotiana otophora、Nicotiana paniculata、Nicotiana pauczjlora、碧冬烟草(Nicotiana petunioides)、白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、Nicotiana quadrivalvis、雷蒙德氏烟草(Nicotiana raimondii)、Nicotiana repanda、莲座叶烟草(Nicotiana rosulata)、Nicotiana rosulata subsp.ingulba、圆叶烟草(Nicotiana rotundifolia)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、赛特氏烟草(Nicotiana setchellii)、拟花烟草(Nicotiana simulans)、茄叶烟草(Nicotiana solanifolia)、Nicotiana spegauinii、斯托克通氏烟草(Nicotiana stocktonii)、香甜烟草(Nicotiana suaveolens)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、Nicotiana thyrsiflora、Nicotiana tomentosa、Nicotiana tomentosifomis、Nicotiana trigonophylla、Nicotiana umbratica、波叶烟草(Nicotiana undulata)、绒毛烟(Nicotiana velutina)、Nicotiana wigandioides,和上述的种间杂交体。

“烟草产品”是指包含由烟草属植物产生的材料的产品,包括例如烟丝、切碎的烟草(shredded tobacco)、用于戒烟的烟碱口香糖和贴片、包括膨胀(膨化)和再造烟草的卷烟用烟草、雪茄烟草、烟斗烟草、香烟、雪茄烟和各种形式的无烟烟草,如咀嚼烟草、鼻烟(snuff、snus)和喉糖(lozenges)。

“转录因子”是使用DNA结合结构域结合与DNA区(通常是启动子区)结合并增加或减少特定基因转录的蛋白质。如果转录因子的表达增加编码生物碱生物合成酶的一种或多种基因的转录并增加生物碱产生,则转录因子“正调节”生物碱生物合成。如果转录因子的表达降低编码生物碱生物合成酶的一种或多种基因的转录并降低生物碱产生,则转录因子“负调节”生物碱生物合成。转录因子基于其DNA结合结构域的相似性进行分类。(参见,例如Stegmaier等人,Genome Inform.15(2):276-86((2004))。植物转录因子的类别包括ERF转录因子;Myc碱性螺旋-环-螺旋转录因子;同源域亮氨酸拉链转录因子;AP2乙烯反应因子转录因子;和B3结构域、生长素反应因子转录因子。

“变体”是偏离特定基因或多肽的标准或给定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语“同种型(isoform)”、“同型(isotype)”和“类似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。通过添加、去除或置换一个或多个氨基酸或核苷酸序列的改变而改变的氨基酸序列可以被认为是变体序列。多肽变体可具有“保守”变化,其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学性质,例如用异亮氨酸置换亮氨酸。多肽变体可具有“非保守”变化,例如用色氨酸取代甘氨酸。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入,或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序,例如Vector NTI Suite(InforMax,MD)软件,找到确定哪些氨基酸残基可被置换、插入或缺失的指导。变体也可以指“改组基因”,例如在Maxygen申请的专利中描述的那些(参见,例如,美国专利号6,602,986)。

如本文所用,术语“约”将为本领域普通技术人员所理解,并且将在某种程度上取决于其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在其所使用的上下文中对于本领域普通技术人员而言是不清楚的,则“约”将意味着多至特定术语的正负10%。

术语“生物活性片段”是指NtERF241的片段,其可以例如结合至也将结合全长NtERF241的抗体。术语“生物活性片段”还可以指NtERF241的片段,其可以例如用于诱导植物中的基因沉默。在一些实施方式中,NtERF241的生物活性片段可为全长序列(氨基酸或核酸)的约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%。SEQ ID NO.3,其描绘了NtERF241的全长氨基酸序列,是246个氨基酸。在其他实施方式中,NtERF241的生物活性肽片段可以是,例如,至少约5个连续氨基酸。在又其他实施方式中,NtERF241的生物活性肽片段可以是约5个连续氨基酸多至约245个连续氨基酸,或在这两个量之间的任何连续氨基酸值,例如但不限于约7、约8、约9、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240或约245个连续氨基酸。SEQ ID NO.2描绘了SEQ ID NO:1的ORF,其描绘了NtERF241的全长序列,包括编码区及其5'和3'上游和下游调节序列。SEQ ID NO.2的长度是741个碱基对。在一些实施方式中,NtERF241的生物活性核酸片段可以是,例如,至少约15个连续核酸。在又其他实施方式中,NtERF241的生物活性核酸片段可以是约15个连续核酸多至约740个连续核酸,或在这两个量之间的任何连续核酸值,例如但不限于约20、约30、约40、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725或约740个连续核酸。

III.调节植物中的生物碱产生

本技术的公开内容涉及NtERF241或其生物活性片段在调节植物中生物碱产生的组合物和方法中的用途。

A.增加生物碱产生

在一些实施方式中,本技术涉及通过过表达对生物碱产生具有正调节作用的转录因子来增加植物中的生物碱。NtERF241基因或其开放阅读框可用于工程化生物碱的过量产生,例如植物或植物细胞中的烟碱生物碱(例如烟碱)。

通过在生物碱生物合成途径中过表达一种或多种编码酶的基因,可以增加生物碱,例如烟碱。参见,例如,Sato等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(1):367-72(2001)。单独地过表达PMT对叶片烟碱含量的作用仅增加了40%,尽管根中PMT转录水平增加了4到8倍,表明该途径其他步骤的限制阻止了更大的作用。因此,本技术考虑过表达对生物碱产生具有预测的正调节作用的转录因子(例如,NtERF241)和至少一种至少一种生物碱生物合成基因,例如A622、NBB1、QPT、PMT和/或MPO,与单独上调生物碱生物合成基因相比,将导致更多的生物碱产生。

根据本技术的该方面,将包含NtERF241、其开放阅读框或其生物活性片段、以及A622、NBB1、QPT、PMT或MPO中的至少一种的核酸构建体引入植物细胞中。示例性核酸构建体可包含例如NtERF241或其生物活性片段和QPT二者。类似地,例如,通过将过量表达NtERF241的转基因植物与过表达QPT的转基因植物杂交,可以产生过表达NtERF241和QPT的基因工程化植物。在连续几轮杂交和选择后,可以选择过表达NtERF241和QPT的基因工程化植物。

B.降低生物碱产生

通过本领域公知的多种方式,例如RNA干扰(RNAi)技术、人工微RNA技术、病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术、反义技术、有义共抑制技术和定向诱变技术,使用本技术的NtERF241转录因子基因序列抑制编码正调节生物碱产生的转录因子的内源基因可以减少生物碱产生。因此,本技术提供了通过抑制NtERF241来降低植物中生物碱含量的方法和构建体。抑制编码正调节生物碱产生的转录因子(例如,NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和/或NtMYC2b)的多于一种基因可以进一步降低植物中的生物碱水平。

以前的报道表明,抑制烟草属中的生物碱生物合成基因降低烟碱生物碱含量。例如,抑制QPT降低烟碱水平。(参见,例如,美国专利号6,586,661)。抑制A622或NBB1也降低烟碱水平(参见例如WO 2006/109197),正如抑制PMT(参见例如Chintapakorn&Hamill,Plant Mol.Biol.53:87-105(2003))或MPO(参见例如,WO 2008/020333和WO 2008/008844;Katoh等人,Plant Cell Physiol.48(3):550-4(2007))。因此,本技术考虑通过抑制A622、NBB1、QPT、PMT和MPO中的一种或多种并抑制NtERF241来进一步降低烟碱类生物碱含量。根据本技术的这个方面,将包含至少NtERF241的生物活性片段和至少A622、NBB1、QPT、PMT和MPO中的一种或多种的生物活性片段的核酸构建体引入细胞或植物。示例性核酸构建体可包含NtERF241和QPT的生物活性片段。

C.使用调节生物碱产生的转录因子序列基因工程化植物和细胞

转录因子序列

本技术的转录因子基因包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中列出的序列,包括至少约15个连续核酸多至约740个连续核酸的其生物活性片段,或这两种量之间的任何连续核酸值,例如但不限于约20、约30、约40、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725或约740个连续核酸。在一些实施方式中,本技术的转录因子基因包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中列出的序列,包括至少约21个连续核苷酸的其生物活性片段,其具有足够长度可用于诱导植物中的基因沉默(Hamilton&Baulcombe,Science,286:950-952(1999))。

本技术还包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的“变体”,其中一个或多个碱基缺失、置换、插入或添加,该变体编码调节生物碱生物合成活性的多肽。因此,具有“具有一个或多个碱基缺失、置换、插入或添加的碱基序列”的序列即使在编码的氨基酸序列具有一个或多个置换、缺失、插入或添加时也保留生理活性。另外,可能存在多种形式的NtERF241,这可能是由于基因产物的翻译后修饰,或者是由于多种形式的转录因子基因。具有这种修饰并且编码调节生物碱生物合成的NtERF241转录因子的核苷酸序列包括在本技术的范围内。

例如,可以缺失聚腺苷酸尾或5'-或3'-末端非翻译区,并且可以缺失碱基至氨基酸缺失的程度。只要不产生框移位,碱基也可以被置换。碱基也可以“添加”至添加氨基酸的程度。然而,必需的是,任何此类修饰都不会导致调节生物碱生物合成的转录因子活性的丧失。在该上下文中,修饰的DNA可以通过修饰本技术的DNA碱基序列来获得,使得编码的多肽中特定位点的氨基酸例如通过位点特异性诱变被置换、缺失、插入或添加。(参见Zoller&Smith,Nucleic Acid Res.10:6487-500(1982))。

转录因子序列可以从适当的碱基从头合成,例如,通过使用本文公开的适当的蛋白质序列作为指导来产生DNA分子,虽然不同于天然DNA序列,但导致具有相同或相似的氨基酸序列的蛋白质的产生。

除非另有说明,否则通过对本文DNA分子测序确定的所有核苷酸序列使用自动DNA测序仪测定,例如Applied Biosystems,Inc.的Model 3730xl。因此,如本领域对于通过该自动化方法确定的任何DNA序列已知的,本文确定的任何核苷酸序列可能包含一些错误。通过自动化确定的核苷酸序列通常与测序的DNA分子的实际核苷酸序列具有至少约95%的同一性,更通常至少约96%至至少约99.9%的同一性。可以通过其他方法更精确地确定实际序列,包括本领域熟知的手动DNA测序方法。也如本领域所知,与实际序列相比,确定的核苷酸序列中的单个插入或缺失将导致核苷酸序列翻译的移码,使得由确定的核苷酸序列编码的预测的氨基酸序列与由测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列可以是完全不同的(从这种插入或缺失的点开始)。

出于本技术的目的,当两个序列在6X SSE、0.5%SDS、5X Denhardt溶液和100μg非特异性运载体DNA的杂交溶液中形成双链复合物时,它们在严格条件下杂交。参见上文Ausubel等,2.9节,增刊27(1994)。序列可以在“中等严格性”下杂交,其在6X SSE、0.5%SDS、5X Denhardt溶液和100μg非特异性运载体DNA的杂交溶液中定义为60℃的温度。对于“高严格”杂交,温度升高至68℃。在中度严格杂交反应后,将核苷酸在2X SSE加0.05%SDS的溶液中在室温下洗涤5次,随后用0.1X SSC加0.1%SOS在60℃洗涤1小时。对于高严格性,洗涤温度升至68℃。出于该技术的目的,杂交的核苷酸是使用1ng具有10,000cpm/ng的特定放射性的放射性标记探针检测的核苷酸,其中杂交的核苷酸在-70℃暴露于X射线胶片不超过72小时后清晰可见。

本技术包括与SEQ ID NO:1-2中任一个中描述的核酸序列至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%同一的核酸分子。两个核酸序列之间的差异可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何位置,分别散布在参考序列中的核苷酸之间或参考序列内的一个或多个连续基团中。

核酸构建体

在本技术的一些实施方式中,将增加调节生物碱生物合成的转录因子活性的序列掺入适于引入植物或细胞的核酸构建体中。因此,这种核酸构建体可用于在植物或细胞中过表达NtERF241,和任选的A622、NBB1、PMT、QPT、MPO、NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b中的至少一种。

可以使用标准技术制备重组核酸构建体。例如,用于转录的DNA序列可以通过用限制酶处理含有该序列的载体以切出合适的区段来获得。用于转录的DNA序列也可以通过退火和连接合成的寡核苷酸或通过在聚合酶链反应(PCR)中使用合成的寡核苷酸以在每个末端给出合适的限制性位点来产生。然后将DNA序列克隆到含有合适调节元件的载体中,例如上游启动子和下游终止子序列。

在本技术的一些实施方式中,核酸构建体包含编码转录因子(即,NtERF241)的序列,该转录因子调节与一种或多种调节或控制序列可操作地连接的生物碱生物合成,所述一种或多种调节或控制序列驱动某些细胞类型、器官或组织中转录因子编码序列的表达,而不会过度影响正常的发育或生理机能。

可用于表达引入细胞以降低或增加调节生物碱生物合成的转录因子表达的核酸序列的启动子可以是组成型启动子,例如香石竹蚀环病毒(CERV),花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子,或更特别是双增强花椰菜花叶病毒启动子,包含两个串联的CaMV 35S启动子(称为“双35S”启动子)。在某些情况下,组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子可以是期望的。例如,组织特异性启动子允许在某些组织中过表达而不影响其他组织中的表达。

示例性启动子包括在根组织中有活性的启动子,比如烟草RB7启动子(参见例如,Hsu等人,Pestic.Sci.44:9-19(1995);美国专利号5,459,252),玉米启动子CRWAQ81(参见例如,美国专利公布号2005/0097633),拟南芥ARSK1启动子(参见例如,Hwang&Goodman,Plant J.8:37-43(1995)),玉米MR7启动子(参见例如,美国专利号5,837,848),玉米ZRP2启动子(参见例如,美国专利号5,633.363),玉米MTL启动子(参见例如,美国专利号5,466,785和6,018,099),玉米MRS1、MRS2、MRS3和MRS4启动子(参见例如,美国专利公布号2005/0010974),拟南芥隐蔽启动子(参见例如,美国专利公布号2003/0106105)和在导致在烟碱生物合成中涉及的酶的升高表达的条件下活化的启动子,比如烟草RD2启动子(参见例如,美国专利号5,837,876)、PMT启动子(参见例如,Shoji等人,Plant Cell Physiol.41:831-39(2000);WO 2002/038588)、或A622启动子(参见例如,Shoji等人,Plant Mol.Biol.50:427-40(2002))。

该技术的载体还可以含有终止序列,其位于本技术的核酸分子的下游,使得终止mRNA的转录,并添加聚腺苷酸序列。示例性终止子包括根癌土壤杆菌胭脂碱合酶终止子(Tnos)、根癌土壤杆菌甘露碱合酶终止子(Tmas)和CaMV 35S终止子(T35S)。终止区包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基终止区(TrbcS)或Tnos终止区。表达载体还可含有增强子、起始密码子、剪接信号序列和靶向序列。

本技术的表达载体还可以含有选择标记,通过该选择标记可以在培养中鉴定转化细胞。标记可以与异源核酸分子缔合,即与启动子可操作地连接的基因。如本文所用,术语“标记”是指编码性状或表型的基因,其允许选择或筛选含有该标记的植物或细胞。例如,在植物中,标记基因将编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或转染的细胞中选择转化细胞。

合适的可选择标记的实例包括但不限于腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦和草铵膦抗性,以及氨基糖苷3'-O-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。这些标记可包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。该构建体还可含有可选择标记基因bar,其赋予对除草剂草丁膦类似物如草铵膦的抗性。参见,例如,Thompson等人,EMBO J.9:2519-23(1987))。也可以使用本领域已知的其他合适的选择标记。

可以使用可见标记,例如绿色荧光蛋白(GFP)。还描述了基于细胞分裂控制来鉴定或选择转化植物的方法。参见例如,WO 2000/052168和WO 2001/059086。

还可包括细菌或病毒来源的复制序列,以允许将载体克隆到细菌或噬菌体宿主中。优选地,使用广泛宿主范围的原核复制起点。可以包括细菌的可选择标记以允许选择携带期望构建体的细菌细胞。合适的原核可选择标记还包括对抗生素如卡那霉素或四环素的抗性。

如本领域已知的,编码额外功能的其他核酸序列也可以存在于载体中。例如,当土壤杆菌是宿主时,可以包括T-DNA序列以促进随后转移和掺入植物染色体。

通过土壤杆菌转化入宿主植物并筛选修饰的生物碱水平,可以适当地筛选这些基因构建体的活性。

适当地,可以从GenBankTM核苷酸数据库中提取基因的核苷酸序列,并搜索不切割的限制酶。可以通过常规方法(例如将这些位点掺入PCR引物中或通过亚克隆)将这些限制性位点添加到基因中。

构建体可以包含在载体内,例如适于在合适的宿主(植物)细胞中表达的表达载体。应当理解,任何能够产生包含引入的DNA序列的植物的载体将是足够的。

适合的载体对于本领域技术人员是熟知的,并且在一般技术参考文献例如Pouwels等人,Cloning Vectors,A Laboratory Manual,Elsevier,Amsterdam(1986)中描述。适合载体的实例包括Ti质粒载体。

在一些实施方式中,本技术提供能够过表达NtERF241的表达载体,用于调节烟碱和其他生物碱(包括各种类黄酮)的产生水平。在一些实施方式中,本技术的表达载体还能够过表达NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种。这些表达载体可以瞬时引入宿主植物细胞或稳定整合到宿主植物细胞的基因组中,以通过本领域技术人员已知的各种方法产生转基因植物。当这些表达载体稳定整合到宿主植物细胞的基因组中以产生稳定的细胞系或转基因植物时,过表达单独NtERF241或与生物碱生物合成酶或另一种转录因子如NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b组合可以配置为调节对该转录因子有响应的内源启动子的启动子活化的方法。可以进一步操作宿主植物细胞以接收对NtERF241有响应的异源启动子构建体。还可以进一步操作宿主植物细胞以接收异源启动子构建体,所述异源启动子构建体通过在感兴趣异源启动子的核心元件的上游掺入一个或多个GAG基序而被修饰。

通过在感兴趣的启动子的上游掺入一个或多个GAG基序和/或衍生GAG基序,可以操纵任何感兴趣的启动子以对茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)有反应。合适的启动子包括可以通过植物细胞的转录机器激活的任何来源的各种启动子,例如各种同源或异源植物启动子和衍生自植物病原体(包括细菌和病毒)的各种启动子。合适的启动子包括组成型活性启动子和诱导型启动子。

关于下文描述的表达载体,编码参与生物碱、类黄酮和烟碱的产生的生物合成途径的酶的各种基因可以适合作为可以与感兴趣的启动子可操作地连接的转基因。

在一些实施方式中,表达载体包含与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的启动子。在另一个实施方式中,植物细胞系包含表达载体,所述表达载体包含与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的启动子。在另一个实施方式中,转基因植物包含表达载体,所述表达载体包含与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的启动子。在另一个实施方式中,提供了用于基因调节生物碱、类黄酮和烟碱的产生的方法,包括:引入包含与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的启动子的表达载体。在一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。

在另一个实施方式中,表达载体包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与生物碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,植物细胞系包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与生物碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,转基因植物包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与生物碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,提供了用于基因调节生物碱的产生水平的方法,包括引入表达载体,所述表达载体包含(a)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(b)与编码参与生物碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。在一些实施方式中,参与生物碱生物合成的酶包括A622、NBB1、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)或N-甲基腐胺氧化酶(MPO)中的一种或多种。

在另一个实施方式中,表达载体包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与类黄酮生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,植物细胞系包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与类黄酮生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,转基因植物包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与类黄酮生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。在另一个实施方式中,提供了用于调节类黄酮的产生水平的方法,包括引入表达载体,所述表达载体包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与类黄酮生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在方法的一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。

在另一个实施方式中,表达载体包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与烟碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,植物细胞系包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与烟碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在另一个实施方式中,转基因植物包含表达载体,其包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与烟碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。在一些实施方式中,参与烟碱生物合成的酶是A622、NBB1、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)或N-甲基腐胺氧化酶(MPO)中的一种或多种。在一些实施方式中,参与烟碱生物合成的酶是PMT。在另一个实施方式中,提供了用于基因调节烟碱的产生水平的方法,包括引入表达载体,所述表达载体包含(i)与编码NtERF241的cDNA可操作地连接的第一启动子,和(ii)与编码参与烟碱生物合成的酶的cDNA可操作地连接的第二启动子。在方法的一些实施方式中,表达载体还包含与编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的cDNA可操作地连接的启动子。

另一个实施方式涉及编码NtERF241(SEQ ID NO:2)的分离的cDNA,或其生物活性片段。另一个实施方式涉及编码NtERF241的分离的cDNA,其与SEQ ID NO:2或其生物活性变体片段具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列同一性。

另一个实施方式涉及包含第一序列的表达载体,所述第一序列包含编码NtERF241并且与SEQ ID NO:2或其生物活性片段具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性的分离的cDNA。在一些实施方式中,表达载体还包含另外的序列,其包含编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的分离的cDNA,并且与SEQ ID NO:4、6、8和10或其片段分别具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性。

另一个实施方式涉及包含表达载体的植物细胞系,所述表达载体包含编码NtERF241并且与SEQ ID NO:2或其片段具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性的分离的cDNA。在一些实施方式中,表达载体还包含另外的序列,其包含编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的分离的cDNA,并且与SEQ ID NO:4、6、8和10或其片段分别具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性。

另一个实施方式涉及包含表达载体的转基因植物,所述表达载体包含编码NtERF241并且与SEQ ID NO:2或其生物活性片段具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性的分离的cDNA。在一些实施方式中,表达载体还包含第二序列,其包含编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的分离的cDNA,并且与SEQ ID NO:4、6、8和10或其片段分别具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性。

另一个实施方式涉及用于基因调节植物中的烟碱水平的方法,包括将表达载体引入植物,所述表达载体包含编码NtERF241的并且与SEQ ID NO:2或其片段具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性分离的cDNA。在一些实施方式中,表达载体还包含第二序列,其包含编码NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b中的至少一种的分离的cDNA,并且与SEQ ID NO:4、6、8和10或其片段分别具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性。

用于抑制调节生物碱产生的转录因子的方法

在本技术的一些实施方式中,提供了用于抑制调节生物碱产生的转录因子、改变生物碱水平和产生具有改变的生物碱水平的植物的方法和构建体。可用于抑制调节生物碱产生的转录因子(例如,NtERF241)的方法的实例包括反义、有义共抑制、RNAi、人工微RNA、病毒诱导的基因沉默(VIGS)、反义、有义共抑制、和靶向诱变方法。

RNAi技术涉及使用RNAi质粒构建体的稳定转化(Helliwell&Waterhouse,Methods Enzymol.392:24-35(2005))。这些质粒由以反向重复结构沉默的靶基因的片段组成。反向重复序列由间隔物隔开,通常是内含子。由合适的启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)驱动的RNAi构建体整合到植物基因组中,随后转基因的转录导致RNA分子自身向后折叠以形成双链发夹RNA。该双链RNA结构被植物识别并切割成称为小干扰RNA(siRNA)的小RNA(约21个核苷酸长)。siRNA与蛋白质复合物(RISC)缔合,后者继续指导靶基因的mRNA降解。

人工微RNA(amiRNA)技术利用微RNA(miRNA)途径,其功能是沉默植物和其他真核生物中的内源基因(Schwab等人,Plant Cell 18:1121-33(2006);Alvarez等人,Plant Cell18:1134-51(2006))。在该方法中,将待沉默基因的21个核苷酸长的片段引入pre-miRNA基因中以形成pre-amiRNA构建体。使用本领域技术人员显而易见的转化方法将pre-miRNA构建体转移到植物基因组中。在转录pre-amiRNA后,加工产生靶向基因的amiRNA,所述基因与21个核苷酸的amiRNA序列共享核苷酸同一性。

在RNAi沉默技术中,两个因素可以影响片段长度的选择。片段越短,通常将实现更少的有效沉默,但是非常长的发夹增加了细菌宿主菌株中重组的机会。沉默的有效性似乎也是基因依赖性的,并且可以反映靶mRNA的可及性或基因活跃的细胞中靶mRNA和hpRNA的相对丰度。片段长度在100和800bp之间,优选在300和600bp之间,通常适合于使获得的沉默效率最大化。另一个考虑因素是待靶向基因的部分。可以使用5'UTR、编码区和3'UTR片段,具有同样好的结果。由于沉默的机制取决于序列同源性,因此存在相关mRNA序列交叉沉默的可能性。在不希望的情况下,应选择与其他序列具有低序列相似性的区,例如5'或3'UTR。避免交叉同源沉默的规则似乎是使用在构建体和非靶基因序列之间不具有超过20个碱基的序列同一性的区段(block)的序列。许多这些相同的原理适用于选择用于设计amiRNA的靶区。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是RNAi技术的变体,其利用植物的内源-抗病毒防御。用含有宿主DNA片段的重组VIGS病毒感染植物导致靶基因的转录后基因沉默。在一个实施方式中,可以使用基于烟草脆裂病毒(TRV)的VIGS系统。基于烟草脆裂病毒的VIGS系统例如在Baulcombe,Curr.Opin.Plant Biol.2:109-113(1999);Lu等人,Methods 30:296-303(2003);Ratcliff等人,The Plant Journal 25:237-245(2001);和美国专利号7,229,829中描述。

反义技术涉及将反义寡核苷酸引入植物中,所述反义寡核苷酸将结合至由感兴趣基因产生的信使RNA(mRNA)。“反义”寡核苷酸具有与基因的信使RNA(mRNA)互补的碱基序列,其被称为“有义”序列。mRNA的有义区段的活性被反义mRNA区段阻断,从而有效地使基因表达失活。在Stam等人,Plant J.21 27-42(2000)中更详细地描述了将反义应用至植物中的基因沉默。

有义共抑制技术涉及将高度表达的有义转基因引入植物中,导致转基因和内源基因二者的表达降低(Depicker和van Montagu,Curr.Opin.Cell Biol.9:373-82(1997))。该作用取决于转基因和内源基因之间的序列同一性。

靶向诱变技术,例如TILLING(定向诱导基因组局部突变技术(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))和使用快中子轰击的“delete-a-gene”,可用于敲除植物中的基因功能(Henikoff等人,Plant Physiol.135:630-6(2004);Li等人,Plant J.27:235-242(2001))。TILLING涉及用诱变剂处理种子或单个细胞以引起点突变,该点突变然后使用用于单核苷酸突变检测的敏感方法在感兴趣的基因中发现。检测期望突变(例如,导致感兴趣基因产物失活的突变)可以通过例如PCR方法完成。例如,可以制备衍生自感兴趣基因的寡核苷酸引物,并且PCR可以用于从诱变群体中的植物扩增感兴趣基因的区。扩增的突变基因可以与野生型基因退火,以发现突变基因和野生型基因之间的错配。检测到的差异可以追溯到具有突变基因的植物,从而揭示哪些诱变植物将具有期望表达(例如感兴趣基因的沉默)。然后可以选择性繁殖这些植物以产生具有期望表达的群体。TILLING可以提供包含错义和敲除突变的等位基因系列,其表现出靶基因的表达降低。TILLING被吹捧为基因敲除的可能方法,其不涉及转基因的引入,因此可能更容易被消费者接受。快中子轰击诱导植物基因组中的突变,即缺失,其也可以使用PCR以类似于TILLING的方式检测。

宿主植物和细胞

在一些实施方式中,本技术涉及通过引入编码调节生物碱生物合成的转录因子(例如,NtERF241)的多核苷酸序列对植物或细胞进行基因操作。因此,本技术提供了用于减少或增加植物中生物碱合成的方法和构建体。另外,本技术提供了在植物细胞中生产生物碱和相关化合物的方法。

本技术中使用的植物可包括适合于基因工程技术的产生物碱的高等植物种类,包括单子叶植物和双子叶植物二者,以及裸子植物。在一些实施方式中,产生物碱的植物包括茄科植物中的烟草属、澳洲毒茄属(Duboisia)、Solanum、Anthocercis和蛾蝶花(Salpiglossis)属或菊科植物中的墨旱莲属和百日草属的产烟碱生物碱的植物。

如本领域已知的,存在多种方式将基因和基因构建体引入植物中,并且植物转化和组织培养技术的组合已经成功地整合到用于产生转基因作物植物的有效策略中。

已经在别处描述了可用于本技术的这些方法(Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42:205-225(1991);Vasil,Plant Mol.Biol.5:925-937(1994);Walden和Wingender,Trends Biotechnol.13:324-331(1995);Songstad等人,Plant Cell,Tissue and Organ Culture 40:1-15(1995)),并且对本领域技术人员是熟知的。例如,本领域技术人员将当然意识到,除了通过真空渗入(Bechtold等人,C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie,316:1194-1199(1993))或伤口接种(Katavic等人,Mol.Gen.Genet.245:363-370(1994))的拟南芥的土壤杆菌介导的转化之外,同样有可能的是转化其他植物和作物物种,使用土壤杆菌Ti质粒介导的转化(例如,hypocotyl(DeBlock等人,Plant Physiol.91:694-701(1989))或子叶柄(Moloney等人,Plant Cell Rep.8:238-242(1989)wound infection),粒子轰击/生物射弹方法(Sanford等人,J.Part.Sci.Technol.5:27-37(1987);Nehra等人,Plant J.5:285-297(1994);Becker等人,Plant J.5:299-307(1994)),或聚乙二醇辅助原生质体转化(Rhodes等人,Science 240:204-207(1988);Shimamoto等人,Nature 335:274-276(1989))方法。

发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可用于产生包括烟草在内的植物的转基因毛状根培养物,例如由Guillon等人,Curr.Opin.Plant Biol.9:341-6(2006)描述的。“烟草毛状根”是指烟草根,其具有来自整合在基因组中的发根土壤杆菌的Ri质粒的T-DNA并在培养物中生长而不补充生长素和其他植物激素。烟草毛状根产生烟碱生物碱作为整个烟草植物的根。

另外,可以通过根瘤菌(Rhizobium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)或中生根瘤菌(Mesorhizobium)转化来转化植物。(Broothaerts等人,Nature 433:629-633(2005))。

在转化植物细胞或植物后,可以通过诸如抗生素抗性、除草剂抗性、对氨基酸类似物的耐受性或使用表型标记的方法选择其中掺入了期望DNA的那些植物细胞或植物。

可以使用各种测定来确定植物细胞是否显示基因表达的变化,例如,RNA印迹或定量逆转录酶PCR(RT-PCR)。可以通过常规方法从转化细胞再生整个转基因植物。这些转基因植物可以繁殖并自花授粉以产生纯合系。这些植物产生含有引入性状的基因的种子,并且可以生长以产生将产生所选表型的植物。

根据本技术实现的经修饰的生物碱含量可与其他感兴趣的性状组合,例如抗病性、抗虫性、高产量或其他性状。例如,含有修饰生物碱含量的合适转基因的稳定的基因工程化转化体可用于将修饰的生物碱含量性状渐渗入期望的商业上可接受的基因背景中,从而获得将修饰的生物碱水平与所述期望背景结合的栽培种或品种。例如,可以使用具有降低的烟碱的基因工程化烟草植物将降低的烟碱性状渐渗入具有抗病性状的烟草栽培种中,例如对TMV、黑胫病或青霉病的抗性。可选地,可以用赋予其他感兴趣性状的核酸构建体转化本技术的经修饰的生物碱含量植物的细胞。

本技术还考虑用编码调节生物碱生物合成的转录因子(例如,NtERF241)的核酸序列对细胞进行基因工程化。

另外,可以向表达生物碱生物合成基因的细胞提供前体以增加生物碱合成的底物可利用性。可以向细胞提供前体类似物,其可以掺入天然存在的生物碱的类似物中。

可以使用合适的技术将根据本技术的构建体引入任何植物细胞中,例如土壤杆菌介导的转化、粒子轰击、电穿孔和聚乙二醇融合,或阳离子脂质介导的转染。

此类细胞可以用本技术的核酸构建体进行基因工程化而不使用可选择的或可见的标记,并且可以通过检测引入的构建体的存在来鉴定转基因生物体。可以测量特定细胞中蛋白质、多肽或核酸分子的存在以确定例如细胞是否已经成功转化或转染。例如,并且作为本领域的常规,可以通过PCR或用于检测特定核酸或多肽序列的其他合适方法检测引入的构建体的存在。另外,通过识别转化细胞与在相似条件下培养的非转化细胞的生长速率或形态特征相比的生长速率或形态特征的差异,可以鉴定基因工程化细胞。参见WO 2004/076625。

本技术还涉及转基因植物细胞培养物,其包含用本文所述的核酸分子转化并表达NtERF241的基因工程化植物细胞。细胞还可以表达至少一种另外的转录因子基因,例如NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b,和/或至少一种烟碱生物合成基因,例如A622、NBB1、QPT、PMT或MPO。

本技术还考虑细胞培养系统,其包含用本文所述的核酸分子转化并表达NtERF241的基因工程化细胞。已经表明,过表达PMT的转基因毛状根培养物为莨菪碱(一种药学上重要的托烷生物碱)的大规模商业生产提供了有效的手段。Zhang等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 101:6786-91(2004)。因此,通过过表达NtERF241可以在烟草毛状根培养物中产生大规模或商业量的烟碱生物碱。同样,本技术考虑了细胞培养系统,例如细菌或昆虫细胞培养物,用于通过表达NtERF241产生大规模或商业量的烟碱生物碱、烟碱类似物或烟碱前体。细胞还可以表达至少一种另外的转录因子基因,例如NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a或NtMYC2b,和/或至少一种烟碱生物合成基因,例如A622、NBB1、QPT、PMT或MPO。

D.量化生物碱含量

在本技术的一些实施方式中,基因工程化植物和细胞的特征在于降低的生物碱含量。

可以通过几种方法测定生物碱水平的定量降低,例如通过基于气液色谱法的定量、高效液相色谱法、放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。

在描述本技术的植物时,短语“减少生物碱的植物”或“降低生物碱的植物”包括生物碱含量降低至小于相同物种或品种的对照植物的生物碱含量的约50%、约40%、约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%的水平的植物。

在本技术的一些实施方式中,基因工程化植物的特征在于增加的生物碱含量。类似地,基因工程化细胞的特征在于增加的生物碱产量。

在描述本技术的植物时,短语“增加生物碱的植物”包括基因工程化植物,其具有大于相同物种或品种的对照植物的生物碱含量的约10%、约25%、约30%、约40%、约50%、约75%、约100%、约125%、约150%、约175%或约200%的生物碱含量增加。

成功地基因工程化细胞的特征在于增加的生物碱合成。例如,与对照细胞相比,本技术的基因工程化细胞可产生更多的烟碱。

烟碱生物碱水平的定量增加可以通过几种方法测定,例如通过基于气液色谱法的定量、高效液相色谱法、放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。

IV.产品

编码预测调节生物碱生物合成的NtERF241转录因子的多核苷酸序列可用于产生具有改变的生物碱水平的植物。此类植物可具有有用的性质,例如在生物碱增加的植物的情况下增加的害虫抗性,或在生物碱降低的植物的情况下降低的毒性和增加的适口性。

本技术的植物可用于生产衍生自植物收获部分的产物。例如,生物碱降低的烟草植物可用于生产用于戒烟的烟碱降低的香烟。生物碱增加的烟草植物可用于生产改良风险烟草产品。

另外,本技术的植物和细胞可用于生产生物碱或生物碱类似物,包括烟碱类似物,其可用作治疗剂、杀虫剂或合成中间体。为此,可以通过多种方法生产大规模或商业量的生物碱和相关化合物,包括从基因工程化植物、细胞或培养系统中提取化合物,包括但不限于毛状根培养物、悬浮培养物、愈伤组织培养物和芽培养物。

实施例

提供以下实施例仅是为了说明而不是为了限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相同或相似结果的各种非关键参数。这些实施例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本技术的范围。

实施例1:转录因子NtERF241

全长NtERF241基因(SEQ ID NO:1)的长度是1900bp。NtERF241的开放阅读框(ORF),其长度为741bp,在SEQ ID NO:2中列出,并且预测编码如在SEQ ID NO:3中列出的246个氨基酸多肽。该基因预计在烟碱生物合成中所起的作用还没有被报道。

通过使用NtERF32(也称为ERF2或EREBP2)的核酸和氨基酸序列搜索SolGenomics数据库,发现了NtERF241基因。所鉴定的基因(其不存在于ERF烟草基因的TOBFAC数据库中)编码与NtERF32相似但不相同的转录因子。由于TOBFAC数据库中的ERF基因列表以NtERF240结尾,因此新发现的基因在本文中命名为NtERF241。通过使用NtERF241基因序列和NCBI网站上可用的自动化计算分析程序建立NtERF241的预测编码序列。

实施例2:NtERF241正调节烟碱生物合成

该实施例证明了NtERF241或其生物活性片段正调节植物和植物细胞培养物中的烟碱生物合成的用途。

方法

植物和细胞培养。普通烟草(Nicotiana tabacum)cv.Burley 21植物如在Reichers,D.E.和Timko,M.P.,Plant Mol.Biol.41:387-401(1999)中描述的生长。普通烟草(N.tabacum)cv.亮黄色(BY-2)细胞悬浮培养物在含有3%(w/v)蔗糖和0.2mg/L 2.4-二氯苯氧基乙酸(2.4-D),pH 5.8的Murashige-Skoog(MS)培养基中生长,并且每7天将等分试样转移到新鲜的MS培养基中以确保细胞维持在对数生长期。对于MeJA处理,将细胞稀释到不含生长素的培养基中,并根据Xu和Timko,Plant Mol.Biol.55:743-761(2004)描述的方法在用50μM MeJA处理之前在28℃下伴随振荡生长1天。用100μM MeJA处理三周龄植物并在处理后24小时收集。

载体构建体。根据Sears等人,Plant Mol.Biol.84:49-66(2014)中描述的方法制备用于过表达分析单独NtERF241或与NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和/或NtMCY2b组合的表达载体。对于RNAi敲低研究,根据Sears等人(2014)中描述的方法制备NtERF241-RNAi载体。

BY-2细胞的土壤杆菌转化。在利用根癌土壤杆菌LBA4404转化的BY-2细胞中进行转基因分析(例如,过表达构建体、RNAi敲低构建体),如在Xu和Timko Plant Mol.Biol.55:743-761(2004)和Zhang等人Mol.Plant 5:73-84(2012)中描述的。在含有50mg/L卡那霉素或15mg/L潮霉素(对于RNAi载体)和500mg/L cefatoxime的MS琼脂,和如上面描述生长的细胞悬浮液上选择转化的愈伤组织。

基因表达分析。使用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA,并根据制造商的方案用ThermoScriptTM RT-PCR System(Invitrogen)反转录。使用基因特异性引物对在扩增试验中使用以下条件进行半定量反转录PCR(RT-PCR):96℃持续1分钟;94℃持续30秒,58℃持续30秒,72℃持续90秒的25个周期;72℃持续10分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离。

如Zhang等人(2012)描述的使用iQTMGreen Supermix(Bio-Rad)进行定量RT-PCR(qRT-PCR)。

BY-2细胞中的生物碱分析。使野生型或转基因BY-2细胞生长并如上所述进行MeJA处理。在处理后72小时,通过真空过滤收集0.5g细胞,在液氮中冷冻并冻干。从干燥样品中提取生物碱,并如Zhang等人(2012)中描述的在Shimadzu GCMS 2010上通过GCMS测量。

结果

据预测,与在相似条件下生长的非转化植物和植物细胞培养物相比,经基因工程化以过表达NtERF241或其生物活性片段的植物和植物细胞培养物将产生增加水平的烟碱生物碱。进一步预期与在单独过表达NtERF241的植物或植物细胞培养物中观察到的相比,NtERF241和至少一种另外的转录因子如NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a和NtMYC2b的组合过表达在这方面将具有协同作用。

等同

本技术不限于本申请中描述的特定实施方式,其旨在作为本技术的各个方面的单个说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对本技术进行许多修改和变化,这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外,本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本技术仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。应理解,本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统,它们当然可以变化。还应理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的,而不是限制性的。

另外,在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到,本公开也因此根据马库什组的任何单个成员或成员子组描述。

如本领域技术人员将理解的,出于任何和所有目的,特别是在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并且使得相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例,本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解,所有语言例如“上至”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所述的数字并指如上所述可以随后分解成子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解的,范围包括每个单独的成员。因此,例如,具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地,具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组,等等。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物,包括GenBank登录号,通过引用整体并入本文,包括所有附图和表格,只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。

所附权利要求书中列出了其他实施方式。

序列表

SEQ ID NO:1(1900bp)

NtERF241基因

GGCGCAAAGAGACTTTAATAAGAAATTACTTAAGTCAAGTTCTTGTGCTATATCTCGTTCGTGATCCCGCCCTGGGAATCACATCACTGCCTTTTGACTGAAGTTCTTAGAAGAGGGAATGCAAAAGAATTAGACTAGGGGCCTTATGCCAATCTTAATCCTTCCTTCACCCCGCCCTGGAATCACTGAACTCCCAAGACGTTATTTCTAATAGACCCTCAATCCGACTTATGTACTCCTTAAAAATTAAGAAAAAGACAAAATTTTGGGGTAATAAATAATGGTAAATGGCTCCCGTCAATGAATGAAAGTCGTTTTCTTATATTGGGCACGTGATAAAAGAACTTGGAAAAAAAGGCTTAAACAACTAGTCCACTTGCCCAGCGAGAAACTTCAAAGAAGCGCAAATACTATTCCTTAATTAATTCAGACATTGAAAGTTTAATGAACTCCTTTTTTCAGGTGCATGTATCTTCATGCTCCACTGTTGTCTCTCTTTTTCACTATATATACCCCAGTCCCTTCTTCTTTTTCAGAATTCTGACCCTTTTCCTCTTCAATAACACAACACTCAAAAAATCCAATTATAACAAACAAAATGTATCAACCCATTTCTACAGAATTCCCAGTATATCACCGGACTTCAAGTTTCAGTAGTCTCATGCCATGTTTGACGGATACTTGGGGTGACTTGCCGTTAAAAGTTGATGATTCCGAAGATATGGTAATTTATGGGCTCTTAAGTGACGCTTTAACTACCGGATGGACGCCGTTTAATTTAACGTCCACCGAAATAAAAGCCGAGCCGAGGGAAGAGATTGAGCCAGCTACGAGTCCTGTTCCTTCAGTGGCTCCACCCGCGGAGACTACGACGGCTCAAGCCGTCGTGCCCAAGGGAAGGCATTATAGGGGCGTCAGGCAAAGGCCGTGGGGGAAATTTGCGGCGGAAATAAGGGACCCAGCTAAAAATGGCGCACGGGTTTGGCTAGGGACTTATGAGACGGCTGAAGAAGCCGCGCTCGCTTATGATAAAGCAGCTTACAGGATGCGCGGCTCCAAGGCTCTATTGAATTTTCCGCATAGGATCGGCTTAAATGAGCCTGAACCGGTTAGGCTGACCGTTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCCGTTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCTAGCTCGTCAATATCACCGGCTTCGGAAAATAGCTTGCCGAAGCGGAGGAGAAAAGCTGTAGCGGCTAAGCAAGCTGAATTAGAAGTGCAGAGCCGATCAAATGTAATGCAAGTTGGGTGCCAAATGGAACAATTTCCAGTTGGCGAGCAGCTATTAGTTAGTTAAGATATGAGCTAAGAACTCAATTGTTAAGTTTGGAGTGAATAGAAACAGCAAACTATTCCACTTTGCTTAGAGGTGGAGAGAGGCAGACCCAAGATTTGAGCACAACGGGGGCATCATTATTTTTAACATAAATATATAAGCTAGTAGCGATAAAATTTAGCGTGCTAACTCCTTCAAAATTTAATGATTATGAGTCAGTGATCAAAAATATCTTTTAAAATATCAAAACTTACTCAAATAAAATCAAGATTAAATATTCGTTAAGTAGTTCAAGCAGAGTCTCAATCTCCATCGCTAAATCGACGGAGGTATGCTACTTTGCCGAAGTGATTTTTGAAGGCACAAGCATTTTGGAGTTTTTTATCGCTCTTTTTAGGCGGAATTTTATTGAATTACTTATTTTAATACAAGTCAAGAAAATGATATGCTTATAAACTTAGTTATCATGATAAACTTAGAGAGAGACATATAAATTGGCTTCTTGCTAATGAAATATTTTATTCCTCTCTAATTTTCTTTAATCTTTTTATGTCTCTCTCTGTTACCTTTTTTAAATTCTAG

SEQ ID NO:2(741bp)

NtERF241ORF

ATGTATCAACCCATTTCTACAGAATTCCCAGTATATCACCGGACTTCAAGTTTCAGTAGTCTCATGCCATGTTTGACGGATACTTGGGGTGACTTGCCGTTAAAAGTTGATGATTCCGAAGATATGGTAATTTATGGGCTCTTAAGTGACGCTTTAACTACCGGATGGACGCCGTTTAATTTAACGTCCACCGAAATAAAAGCCGAGCCGAGGGAAGAGATTGAGCCAGCTACGAGTCCTGTTCCTTCAGTGGCTCCACCCGCGGAGACTACGACGGCTCAAGCCGTCGTGCCCAAGGGAAGGCATTATAGGGGCGTCAGGCAAAGGCCGTGGGGGAAATTTGCGGCGGAAATAAGGGACCCAGCTAAAAATGGCGCACGGGTTTGGCTAGGGACTTATGAGACGGCTGAAGAAGCCGCGCTCGCTTATGATAAAGCAGCTTACAGGATGCGCGGCTCCAAGGCTCTATTGAATTTTCCGCATAGGATCGGCTTAAATGAGCCTGAACCGGTTAGGCTGACCGTTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCCGTTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCTAGCTCGTCAATATCACCGGCTTCGGAAAATAGCTTGCCGAAGCGGAGGAGAAAAGCTGTAGCGGCTAAGCAAGCTGAATTAGAAGTGCAGAGCCGATCAAATGTAATGCAAGTTGGGTGCCAAATGGAACAATTTCCAGTTGGCGAGCAGCTATTAGTTAGTTAA

SEQ ID NO:3(246AA)

NtERF241多肽

MYQPISTEFPVYHRTSSFSSLMPCLTDTWGDLPLKVDDSEDMVIYGLLSDALTTGWTPFNLTSTEIKAEPREEIEPATSPVPSVAPPAETTTAQAVVPKGRHYRGVRQRPWGKFAAEIRDPAKNGARVWLGTYETAEEAALAYDKAAYRMRGSKALLNFPHRIGLNEPEPVRLTVKRRSPEPAVKRRSPEPASSSISPASENSLPKRRRKAVAAKQAELEVQSRSNVMQVGCQMEQFPVGEQLLVS

SEQ ID NO:4(2046 bp)

NtMYC1a ORF

SEQ ID NO:5(681AA)

NtMYC1a多肽

SEQ ID NO:6(2040 bp)

NtMYC1b ORF

SEQ ID NO:7(679AA)

NtMYC1b多肽

SEQ ID NO:8(2214bp)

NtMYC2a基因

CACACACTCTCTCCATTTTCACTCACTCCTTATCACCAAACAATTCTTGGGTGTTTGAATATATACCCGAAATAATTTCCTCTCTGTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCTGTTTTTTTTTCTTGATTTTGTTATATGGAATGACGGATTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACTACATCCGATGATAATATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGCCCGGAACAACTACTACACCAACTCCCCGGAGTTCAGTTTCTCCAGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCTATGCCATATTTCAACCAAGAGTCACTGCAACAGCGACTCCAGACTTTAATCGATGGGGCTCGCAAAGGGTGGACGTATGCCATATTTTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGCGAGCCCCTCGGTTTTGGGGTGGGGAGATGGGTATTATAAAGGTGAAGAAGATAAAAATAAGCGTAAAACGGCGTCGTTTTCGCCTGACTTTATCACGGAACAAGCACACCGGAAAAAGGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACCGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACTGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCCATGACACAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCGATGTATAGTTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAACAGAGAGATTAGCTGTTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATTGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGACTGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAGTTTTGTTTAATTTTAATATTGATATGGGTGCGACTACGGGCTCAGGATCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCCGAGCCCGATCCTTCAGCCCTTTGGCTGACTGATCCGGCTTCTTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGGAATACCAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGGTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTCGGTATGGAAATGGGAATGCGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTGAGTCTGGTGAAATCTTGAATTTTGGTGATAGTACTAAGAGGAGTGCTTGCAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCACAGTTCGGGCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAACGATGAAGGAATCCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATTTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCAATCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAAGCCGAGGAAACGAGGGAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGACAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGAGGACTTGAGGAACCAAATCGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCCCCGTCAAATCAAGAACTCAAGATTGTAGATATGGACATCGACGTTAAGGTGATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGACCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACTGTGAAAATGGGAAGCCGGCTTTACACGCAAGAACAACTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGAAGAGAAATACAGTAAATGGAAATTATCATAGTGAGCTCTGAATAATGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTAAGAGAATTTCTCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:9(659AA)

NtMYC2a多肽

SEQ ID NO:10(2391bp)

NtMYC2b基因

GTAACAAACCCTCTCCATTTTCACTCACTCCAAAAAACTTTCCTCTCTATTTTTTCTCTCTGTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGGGAGTTTTTTTTCTTCTTGTTTTTGTTATATGGAATGACGGACTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACAACATCCGACGATAACATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGGCCGGAACAAATACACCAACTCCACGGAGTTCAGTTTCTCCGGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCGATGCCGTATTTCAACCAAGAGTCGCTGCAACAGCGACTCCAGACGTTAATCGACGGGGCTCGCGAAGCGTGGACTTACGCCATATTCTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGTGAGCCCCTCGGTGTTGGGGTGGGGAGATGGATATTATAAAGGAGAAGAAGACAAGAATAAGCGTAAAACGGCGGCGTTTTCGCCTGATTTTATTACGGAGCAAGAACACCGGAAAAAAGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACTGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACGGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCAATGACTCAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCTATGTACAGCTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAAGAGAAAGATTAGCTGCTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATGGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGAGCGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAATCTTGTTTGATTTTAATATTGATATGGGCGCGACTACGGGCTCAGGTTCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCTGAGCCCGATCCTTCAACCCTTTGGCTTACGGATCCACCTTCCTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGTAATAGTAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGTTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTAGGAGTGGAAATGGGAATGTGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTAGAAATGCTTCAAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCGCAGTTCGGTCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAATGAAGAAGGAATGCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATCTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCATTCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAGGCCGAGGAAACGAGGAAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGGCAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGATGAGTTGAGGAACCAAATTGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCACCGCCAAATCAAGATCTCAAGATTGTAGATATGGATATCGACGTTAAAGTCATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGGCCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACAGTGAAAATGGGGAGCCGGCTTTACACGCAAGAGCAGCTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGAAGAGAAATACAGTAAATGGAAATTATTAGTGAGCTCTGAATAATGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTAAGAGAATTTCTCCTATAGTTAGATCTTGAGATTAAGGCTACTTAAAAGTGGAAAGTTGATTGAGCTTTCCTCTTAGTTTTTTGGGTATTTTTCAACTTTTATATCTAGTTTGTTTTCCACATTTTCTGTACATATAATGTGAAACCAATACTAGATCTCAAGATCTGGTTTTTAGTTCTGTAATTAGAAATAAATATGCAGCTTCATCTTTTTCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:11(658AA)

NtMYC2b多肽

再多了解一些
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