生产目标物质的方法与流程

文档序号:17930504发布日期:2019-06-15 00:48
本发明涉及通过使用微生物生产目标物质,诸如香草醛和香草酸的方法。发明背景香草醛是提供香草气味的主要成分,并且用作食品、饮料、香水等中的芳香物。香草醛通常通过从天然产物中提取或通过化学合成来生产。已经尝试在生产香草醛的方法中尝试生物工程技术,例如通过使用各种微生物与丁香油酚、异丁香油酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子壳等(KaurB.andChakrabortyD.,Biotechnologicalandmolecularapproachesforvanillinproduction:areview.ApplBiochemBiotechnol.2013Feb;169(4):1353-72)。另外,使用生物工程技术生产香草醛的其他方法包括以糖苷生产(WO2013/022881和WO2004/111254),使用香草醛合酶从阿魏酸生产香草醛(JP2015-535181),通过大肠杆菌发酵来生产香草酸,然后将香草酸酶促转化为香草醛(美国专利No.6,372,461)。烯醇化酶是糖分解途径的酶,其催化将2-磷酸-D-甘油酸脱水以生成磷酸烯醇丙酮酸的反应。烯醇化酶的实例可以包括Eno蛋白,其由eno基因编码。发明概述本发明描述了用于改善目标物质诸如香草醛和香草酸的生产的新技术,因此提供了用于有效生产目标物质的方法。本发明的一方面是通过以烯醇化酶的活性得以降低的方式修饰微生物,微生物可以以显著改善的方式生产目标物质诸如香草酸。本发明的一方面提供了生产目标物质的方法,所述方法包括以下步骤:通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比烯醇化酶的活性得以降低的方式进行了修饰,且其中所述目标物质选自由以下组成的组:L-甲硫氨酸、需要S-腺苷甲硫氨酸来进行生物合成的代谢物和它们的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述生产包括:在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述生产包括:通过使用所述微生物来将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述转化包括:在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述转化包括:在反应混合物中允许所述微生物的细胞作用于所述前体以在所述反应混合物中生产和积累所述目标物质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述细胞是存在于所述微生物的培养液中的细胞、从所述培养液中收集的细胞、存在于所述培养液的加工产物中的细胞、存在于收集的细胞的加工产物中的细胞,或这些的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述前体选自由以下组成的组:原儿茶酸、原儿茶醛、L-色氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酸和它们的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,所述方法还包括收集所述目标物质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述烯醇化酶是由eno基因编码的蛋白质。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述eno基因编码选自由以下组成的组的蛋白质:(a)包含SEQIDNO:129的氨基酸序列的蛋白质,(b)包含SEQIDNO:129的氨基酸序列,且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质,且其中所述蛋白质具有烯醇化酶活性,和(c)包含与SEQIDNO:129的氨基酸序列具有90%或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质,且其中所述蛋白质具有烯醇化酶活性。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中通过弱化编码烯醇化酶的基因的表达或通过破坏编码烯醇化酶的基因来降低烯醇化酶的活性。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中通过对所述基因的表达控制序列进行修饰来弱化编码烯醇化酶的基因的表达。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌细菌或酵母。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物是属于棒状杆菌属的细菌。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物是大肠杆菌。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述代谢物选自由以下组成的组:香草醛、香草酸、褪黑激素、麦角硫因、麦根酸、阿魏酸、多胺、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和肌酸。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与所述目标物质的生物合成的酶的活性得以增加的方式进行了进一步修饰。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述参与目标物质的生物合成的酶选自由以下组成的组:3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、O-甲基转移酶、芳族醛氧化还原酶和它们的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性得以增加的方式进行了进一步的修饰。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与除所述目标物质以外的物质的副生产的酶的活性得以降低的方式进行了进一步的修饰。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述参与除目标物质以外的物质的副生产的酶选自由以下组成的组:香草酸脱甲基酶、原儿茶酸3,4-双加氧酶、醇脱氢酶、莽草酸脱氢酶和它们的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加的方式进行了进一步修饰。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述L-半胱氨酸生物合成酶是由选自由以下组成的组的基因编码的蛋白质:cysI基因、cysX基因、cysH基因、cysD基因、cysN基因、cysY基因、cysZ基因、fpr2基因和它们的组合。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中通过增加由cysR基因编码的蛋白质的活性来增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。本发明的另一方面提供了如上文描述的方法,其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比由NCgl2048基因编码的蛋白质的活性得以降低的方式进行了进一步的修饰。本发明的另一方面提供了生产香草醛的方法,所述方法包括:通过如上文所述的方法来生产香草酸;和将所述香草酸转化成香草醛。发明详述<1>微生物如本文所述的微生物是具有生产目标物质的能力的微生物,所述微生物已经以烯醇化酶的活性得以降低的方式进行了修饰。生产目标物质的能力也可以称为“目标物质生产能力”。<1-1>具有目标物质生产能力的微生物短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指能够生产目标物质的微生物。短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指在微生物用于发酵方法的情况下能够通过发酵生产目标物质的微生物。也就是说,短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指能够从碳源生产目标物质的微生物。具体而言,短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指当在含有碳源的培养基等培养基中培养时能够在培养基中以一定程度生产并积累目标物质,从而可以从培养基中收集目标物质的微生物。短语“具有目标物质生产能力的微生物”还可以指在将微生物用于生物转化方法的情况下能够通过生物转化生产目标物质的微生物。也就是说,短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指能够从目标物质的前体生产目标物质的微生物。具体而言,短语“具有目标物质生产能力的微生物”可以指当在含有目标物质的前体的培养基中培养时,能够在培养基中以一定程度生产并积累目标物质,从而可以从培养基中收集目标物质的微生物。具体而言,短语“具有目标物质生产能力的微生物”还可以指能够在被允许作用于反应混合物中的目标物质的前体时在反应混合物中以一定程度生产和积累目标物质,从而可以从反应混合物中收集目标物质的微生物。具有目标物质生产能力的微生物可以是能够在培养基或反应混合物中以比用非修饰菌株可以获得的量更大的量生产和积累目标物质的微生物。非修饰的菌株也可以称为“非修饰的微生物的菌株”。短语“非修饰微生物的菌株”或“非修饰的菌株”可以指尚未以烯醇化酶的活性得以降低的方式进行修饰的对照菌株。具有目标物质生产能力的微生物可以能够在培养基或反应混合物中以例如0.01g/L以上、0.05g/L以上或0.09g/L以上的量积累目标物质。目标物质可以选自L-甲硫氨酸和需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)进行生物合成的代谢物。需要SAM进行生物合成的代谢物的实例可以包括例如香草醛、香草酸、褪黑激素、麦角硫因、麦根酸、阿魏酸、多胺、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和肌酸。微生物可以能够仅产生一种目标物质的能力,或者可以能够产生两种或更多种目标物质的能力。此外,微生物可以能够从目标物质的一种前体或目标物质的两种或更多种前体产生目标物质的能力。当目标物质是能够形成盐的化合物时,目标物质可以作为游离化合物,其盐或它们的混合物获得。也就是说,除非另有说明,术语“目标物质”可以指游离形式的目标物质、其盐或其混合物。盐的实例可以包括例如硫酸盐,盐酸盐,碳酸盐,铵盐,钠盐和钾盐。作为目标物质的盐,可以使用一种盐,或者可以组合使用两种或更多种盐。可以用作亲本菌株以构建如本文中描述的微生物的微生物没有特别限制。微生物的实例可以包括细菌和酵母。细菌的实例可以包括属于肠杆菌科的细菌和棒状杆菌细菌。属于肠杆菌科的细菌的实例可以包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根菌属(Morganella)的细菌。具体地,可以使用根据用于NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库的分类学(ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)分类为肠杆菌科的细菌。埃希氏菌属细菌没有特别限制,并且其实例可以包括根据微生物学领域技术人员已知的分类学分类为埃希氏菌属的细菌。埃希氏菌属细菌的实例可以包括例如记载于Neidhardtetal.(BackmannB.J.,1996,DerivationsandGenotypesofsomemutantderivativesofEscherichiacoliK-12,pp.2460-2488,Table1,InF.D.Neidhardt(编),EscherichiacoliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/第二版,AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.)工作中的那些细菌。埃希氏菌属细菌的实例可以包括例如大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例可以包括大肠杆菌K-12菌株,诸如W3110菌株(ATCC27325)和MG1655菌株(ATCC47076);大肠杆菌K5菌株(ATCC23506);大肠杆菌B菌株,诸如BL21(DE3)菌株;以及其衍生菌株。肠杆菌属细菌没有特别限制,并且其实例可以包括根据微生物学领域技术人员已知的分类学分类为肠杆菌属的细菌。肠杆菌属细菌的实例可以包括例如聚团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。聚团肠杆菌的具体实例可以包括例如聚团肠杆菌ATCC12287菌株。产气肠杆菌的具体实例可以包括例如产气肠杆菌ATCC13048菌株、NBRC12010菌株(Biotechnol.Bioeng.,2007,Mar.27;98(2):340-348)和AJ110637菌株(FERMBP-10955)。肠杆菌属细菌的实例还可以包括例如记载于欧洲专利申请公开(EP-A)No.0952221中的菌株。另外,聚团肠杆菌还可以包括分类为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)的一些菌株。泛菌属细菌没有特别限制,并且其实例可以包括根据微生物学领域技术人员已知的分类学分类为泛菌属的细菌。泛菌属细菌的实例可以包括例如菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成团泛菌和柠檬泛菌(Pantoeacitrea)。菠萝泛菌的具体实例可以包括例如菠萝泛菌LMG20103菌株、AJ13355菌株(FERMBP-6614)、AJ13356菌株(FERMBP-6615)、AJ13601菌株(FERMBP-7207)、SC17菌株(FERMBP-11091)、SC17(0)菌株(VKPMB-9246)和SC17sucA菌株(FERMBP-8646)。一些肠杆菌属细菌和欧文氏菌属细菌重新分类为泛菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989);Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如,基于16SrRNA等的核苷酸序列分析,一些聚团肠杆菌菌株最近重新分类为成团泛菌、菠萝泛菌、斯氏泛菌等(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。泛菌属细菌可以包括如上文描述的重新分类为泛菌属的那些细菌。欧文氏菌属细菌的实例可以包括解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)。克雷伯氏菌属细菌的实例可以包括植物克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)。棒状杆菌细菌的实例可以包括属于棒杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、细杆菌属(Microbacterium)等的细菌。此类棒状杆菌细菌的具体实例可以包括以下物种。嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)解烷棒状杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)帚石南棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)钝齿棒状杆菌(Corynebacteriumcrenatum)谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)(有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens))力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)二歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)(谷氨酸棒杆菌)黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)(谷氨酸棒杆菌)未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)硫殖短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)产氨短杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)(Corynebacteriumstationis)白色短杆菌(Brevibacteriumalbum)蜡状短杆菌(Brevibacteriumcerinum)嗜氨细杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)棒状杆菌细菌的具体实例可以包括以下菌株。嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)ATCC15806解烷棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)ATCC21511帚石南棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)ATCC15991钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)AS1.542谷氨酸棒杆菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060,ATCC13869,FERMBP-734百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)ATCC15990栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)ATCC17965有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)(热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes))AJ12340(FERMBP-1539)力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)ATCC13868二歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(FERMBP-2205)未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)ATCC13825解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066硫殖短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)ATCC19240产氨短杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)(停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis))ATCC6871,ATCC6872白色短杆菌(Brevibacteriumalbum)ATCC15111蜡状短杆菌(Brevibacteriumcerinum)ATCC15112嗜氨细杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354棒状杆菌细菌可以包括先前被分类为短杆菌属但目前并入棒状杆菌属中的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外,停滞棒杆菌可以包括先前已被分类为产氨棒状杆菌,但目前基于16SrRNA的核苷酸序列分析等重新分类为停滞棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。酵母可以是芽殖酵母或裂殖酵母。酵母可以是单倍体或二倍体以上的多倍体酵母。酵母的实例可包括属于酵母属(Saccharomyces)的酵母,例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),属于毕赤酵母属(Pichia)(其也可以称为Wickerhamomyces属)的酵母,如西弗毕赤酵母(Pichiaciferrii),赛道威毕赤酵母(Pichiasydowiorum)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris),属于假丝酵母属(Candida)的酵母,诸如实用假性酵母(Candidautilis),属于汉逊酵母属(Hansenula)的酵母,如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和属于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)的酵母,如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址:P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica;或atcc.org)获得。也就是说,注册号被赋予各自的菌株,并且菌株可以通过使用这些注册号订购(参见atcc.org)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了菌株的注册号。这些菌株也可以从例如菌株保藏的保藏所获得。微生物可以固有具有目标物质生产能力,或者可以已经以使它具有目标物质生产能力的方式进行了修饰。具有目标物质生产能力的微生物可以通过赋予如上所述的此类微生物以目标物质生产能力或增强如上提及的此类微生物的目标物质生产能力来获得。以下,说明赋予或提高目标物质生成能力的方法的具体实例。为了赋予或提高目标物质生产能力,下面举例说明的此类修饰可以独立使用,或者以适当组合使用。目标物质可以通过参与目标物质生物合成的酶的作用产生。此类酶也可以称为“目标物质生物合成酶”。因此,微生物可以具有目标物质生物合成酶。换言之,微生物可以具有编码目标物质生物合成酶的基因。此类基因也可以称为“目标物质生物合成基因”。微生物可以固有具有目标物质生物合成基因,或者可以已经引入了目标物质生物合成基因。本文解释了用于引入基因的方法。另外,通过提高目标物质生物合成酶的活性,可以改善微生物的目标物质生产能力。也就是说,赋予或提高目标物质生成能力的方法的实例可以包括提高目标物质生物合成酶的活性的方法。也就是说,微生物可以经修饰而使得增加了目标物质生物合成酶的活性。一种目标物质生物合成酶的活性可以得以增加,或者两种或更多种目标物质生物合成酶的活性可以得以增加。本文描述了用于增加蛋白质(诸如酶等)的活性的方法。通过例如增加编码蛋白质的基因的表达,可以提高蛋白质(诸如酶等)的活性。目标物质可以从例如碳源和/或目标物质的前体产生。因此,目标物质生物合成酶的实例可以包括例如催化从碳源和/或前体向目标物质转化的酶。例如,3-脱氢莽草酸可以通过部分莽草酸途径产生,其可以包括由3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶),3-脱氢奎尼酸合酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶催化的步骤;可以通过3-脱氢莽草酸脱水酶(DHSD)的作用将3-脱氢莽草酸转化为原儿茶酸;可以通过O-甲基转移酶(OMT)或芳香醛氧化还原酶,诸如芳香羧酸还原酶,ACAR的作用将原儿茶酸分别转化为香草酸或原儿茶醛;以及可以通过ACAR或OMT的作用将香草酸或原儿茶醛转化为香草醛。也就是说,目标物质生物合成酶的具体实例可以包括例如DAHP合酶,3-脱氢奎尼酸合酶,3-脱氢奎尼酸脱水酶,DHSD,OMT和ACAR。术语“3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)”可以指具有催化将D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸转化成3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚糖酮酸7-磷酸(DAHP)和磷酸的反应的活性的蛋白质(EC2.5.1.54)。编码DAHP合酶的基因也可以称为“DAHP合酶基因”。DAHP合酶的实例可以包括分别由aroF、aroG和aroH基因编码的AroF、AroG和AroH蛋白。在这些中,AroG可以作为主要的DAHP合酶发挥功能。DAHP合酶诸如AroF、AroG和AroH蛋白的实例包括各种生物体如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌和棒状杆菌细菌的那些。DAHP合酶的具体实例可以包括大肠杆菌天然的AroF、AroG和AroH蛋白。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的aroG基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,并且由该基因编码的AroG蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。DAHP合酶活性可以通过例如将酶与底物,诸如D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸温育并测量DAHP的酶和底物依赖性生成来测量。术语“3-脱氢奎尼酸合酶”可以指具有催化使DAHP脱磷酸化以产生3-脱氢奎宁酸的反应的活性的蛋白质(EC4.2.3.4)。编码3-脱氢奎尼酸合酶的基因也可以称为“3-脱氢奎尼酸合酶基因”。3-脱氢奎尼酸合酶的实例可以包括由aroB基因编码的AroB蛋白。3-脱氢奎尼酸合酶如AroB蛋白的实例可以包括各种生物体如肠杆菌科细菌和棒状杆菌细菌天然的那些。3-脱氢奎尼酸合酶的具体实例可以包括大肠杆菌天然的AroB。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的aroB基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示,并且由该基因编码的AroB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。3-脱氢奎尼酸合酶活性可以通过例如将酶与底物,诸如DAHP温育并测量3-脱氢奎宁酸的酶和底物依赖性产生来测量。术语“3-脱氢奎尼酸脱水酶”可以指具有催化使3-脱氢奎宁酸脱水以生成3-脱氢莽草酸的反应的活性的蛋白质(EC4.2.1.10)。编码3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因也可以称为“3-脱氢奎尼酸脱水酶基因”。3-脱氢奎尼酸脱水酶的实例可以包括由aroD基因编码的AroD蛋白。3-脱氢奎尼酸脱水酶诸如AroD蛋白的实例可以包括各种生物体如肠杆菌科细菌和棒杆菌的那些。3-脱氢奎尼酸脱水酶的具体实例可以包括大肠杆菌天然的AroD蛋白。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的aroD基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示,并且由该基因编码的AroD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。3-脱氢奎尼酸脱水酶活性可以通过例如将酶与底物,诸如3-脱氢奎宁酸温育并测量3-脱氢莽草酸的酶和底物依赖性产生来测量。术语“3-脱氢草酸脱水酶(DHSD)”可以指具有催化使3-脱氢莽草酸脱水以生成原儿茶酸的反应的活性的蛋白质(EC4.2.1.118)。编码DHSD的基因也可以称为“DHSD基因”。DHSD的实例可以包括由asbF基因编码的AsbF蛋白。DHSD例如AsbF蛋白的实例包括各种生物体如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis),粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)和Podosporapauciseta天然的那些。苏云金芽孢杆菌BMB171菌株天然的asbF基因的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示,并且由该基因编码的AsbF蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。DHSD活性可以通过例如将酶与底物,诸如3-脱氢莽草酸温育并测量原儿茶酸的酶和底物依赖性产生来测量。编码莽草酸途径的酶如DAHP合酶,3-脱氢奎尼酸合酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因的表达受到酪氨酸阻遏物TyrR阻遏,所述TyrR其由tyrR基因编码。因此,莽草酸途径酶的活性也可以通过降低酪氨酸阻遏物TyrR的活性而增加。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的tyrR基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示,并且由该基因编码的TyrR蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。术语“O-甲基转移酶(OMT)”可以指具有在甲基供体存在下催化物质的羟基的甲基化反应的活性的蛋白质(EC2.1.1.68等)。此活性也可以称为“OMT活性”。编码OMT的基因也可以称为“OMT基因”。根据在如本文中所述的方法中生产目标物质的特定生物合成途径,OMT可以具有需要的底物特异性。例如,当经由原儿茶酸向香草酸的转化生产目标物质时,可以使用至少对原儿茶酸特异性的OMT。此外,例如,当经由原儿茶醛向香草醛的转化生产目标物质时,可以使用至少对原儿茶醛特异性的OMT。也就是说,具体地,术语“O-甲基转移酶(OMT)”可以指具有催化在存在甲基基团供体的情况下使原儿茶酸和/或原儿茶醛甲基化(即间位上的羟基基团的甲基化)以产生香草酸和/或香草醛的反应的活性的蛋白质。OMT可以对作为底物的原儿茶酸和原儿茶醛两者是特异性的,但不一定限于此。也就是说,可以采用具有所需底物特异性的OMT,这取决于在本发明的方法中生产目标物质的生物合成途径的类型。OMT通常可以使用原儿茶酸和原儿茶醛两者作为底物,但是不必然限于此。甲基基团供体的实例可以包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。OMT的实例可以包括各种生物体天然的OMT,诸如智人(Homosapiens)(Hs)天然的OMT(GenBank登录号NP_000745和NP_009294)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)天然的OMT(GenBank登录号NP_200227和NP_009294)、Fragariaxananassa天然的OMT(GenBank登录号AAF28353)以及WO2013/022881A1中示例的哺乳动物、植物和微生物的其他各种OMT。对于智人天然的OMT基因,已知四种转录物变体和两种OMT同种型。这四种转录物变体(转录物变体1-4,GenBank登录号NM_000754.3,NM_001135161.1,NM_001135162.1和NM_007310.2)的核苷酸序列显示为SEQIDNO:11至14,较长OMT同种型(MB-COMT,GenBank登录号NP_000745.1)的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示,并且较短OMT同种型(S-COMT,GenBank登录号NP_009294.1)的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。SEQIDNO:16对应于截短了N端的50个氨基酸残基的SEQIDNO:15。OMT的实例可以进一步包含拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌,即属于拟杆菌门的细菌天然的OMT。拟杆菌门细菌的实例可以包括属于Niastella、Terrimonas、Chitinophaga等属的细菌(InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(2007),57,1828-1833)。Niastella细菌的实例可以包括Niastellakoreensis。Niastellakoreensis天然的OMT基因的核苷酸序列以SEQIDNO:130显示,并且由此基因编码的OMT的氨基酸序列以SEQIDNO:131显示。OMT还可以催化原儿茶酸和/或原儿茶醛的甲基化反应以产生异香草酸和/或异香草醛(即对位羟基的甲基化)作为副反应。OMT可以选择性催化间位羟基的甲基化的。表述“选择性催化间位羟基的甲基化”可以意味着OMT选择性地从原儿茶酸生成香草酸的OMT和/或选择性地从原儿茶醛生成香草醛的OMT。表述“从原儿茶酸选择性产生香草酸”可以表示当允许OMT作用于原儿茶酸时按摩尔比计,OMT产生香草酸的量为异香草酸的量的例如3倍或更多,5倍或更多,10倍或更多,15倍或更多,20倍或更多,25倍或更多,或30倍或更多。此外,表述“从原儿茶醛选择性产生香草酸”可以表示当允许OMT作用于原儿茶醛时按摩尔比计,OMT产生香草醛的量为异香草酸的量的例如3倍或更多,5倍或更多,10倍或更多,15倍或更多,20倍或更多,25倍或更多,或者30倍或更多。选择性催化间位羟基甲基化的OMT的实例可以包括本文所述的具有“特定突变”的OMT。具有“特定突变”的OMT也可以称为“突变体OMT”。编码突变体OMT的基因也可以称为“突变体OMT基因”。不具有“特定突变”的OMT也可以称为“野生型OMT”。编码野生型OMT的基因也可以称为“野生型OMT基因”。本文中提及的术语“野生型”是为了方便将“野生型”OMT与“突变体”OMT区分开而使用,并且“野生型”OMT不限于作为天然物质获得的那些,并且可以包括任何没有“特定突变”的OMT。野生型OMT的实例可以包括例如上面例示的OMT。另外,上述例示的所有OMT保守变体应当认为包括在野生型OMT中,条件是此类保守变体不具有“特定突变”。“特定突变”的实例可以包括WO2013/022881A1中描述的突变体OMT中包含的突变。也就是说,“特定突变”的实例可以包括野生型OMT的198位亮氨酸残基(L198)被比亮氨酸残基的疏水性指数(hydrophobicindex)具有更低疏水性指数(亲水性指数(hydropathyindex))的氨基酸残基取代的突变,以及野生型OMT的199位谷氨酸残基(E199)被在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基取代的突变。突变体OMT可以具有这些突变中的一个或两者。“比亮氨酸残基的疏水性指数具有更低疏水性指数(亲水指数)的氨基酸残基”的实例可以包括Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr。作为“比亮氨酸残基的疏水性指数具有更低疏水性指数(亲水指数)的氨基酸残基”,特别地优选选自Ala,Arg,Asn,Asp,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr的氨基酸残基,并且Tyr是更具体的实例。“在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基”可以包括Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr和Val。作为“在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基”,Ala和Gln是具体的实例。任意的野生型OMT中的“L198”和“E199”可以指“与以SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的第198位的亮氨酸残基对应的氨基酸残基”和“与以SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的第199位谷氨酸残基对应的氨基酸残基”。这些氨基酸残基的位置表示相对位置,并且其绝对位置可以由于氨基酸残基的缺失,插入,添加等而改变。例如,若在SEQIDNO:16所示的氨基酸序列中的位置X的N端侧的位置缺失或插入一个氨基酸残基,则原来在位置X处的氨基酸残基重新定位在位置X-1或X+1,但仍被认为是“与SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的X位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”。此外,虽然“L198”和“E199”通常分别是亮氨酸残基和谷氨酸残基,但它们可以不是亮氨酸残基和谷氨酸残基。也就是说,当“L198”和“E199”分别不是亮氨酸残基和谷氨酸残基时,“特定突变”可以包括那些氨基酸残基各自被任何上述氨基酸残基替换的突变。在任意OMT的氨基酸序列中,哪个氨基酸残基为对应于“L198”或“E199”的氨基酸残基可以通过将任意OMT的氨基酸序列和SEQIDNO:16的氨基酸序列比对确定。比对可以通过例如使用已知的基因分析软件来进行。此类软件的具体实例可以包括由HitachiSolutions生产的DNASIS,Genetyx生产的GENETYX等(ElizabethC.Tyleretal.,ComputersandBiomedicalResearch,24(1)72-96,1991;BartonGJetal.,JournalofMolecularBiology,198(2),327-37,1987)。例如,可以通过修饰野生型OMT基因使得由其编码的OMT具有“特定突变”来获得突变体OMT基因。待修饰的野生型OMT基因可以通过例如从具有野生型OMT基因的生物体的克隆或化学合成来获得。此外,也可以不使用野生型OMT基因而获得突变体OMT基因。例如,可以通过化学合成直接获得突变体OMT基因。获得的突变OMT基因可以原样使用,或者在使用前进一步修饰。基因可以使用已知的方法进行修饰。例如,可以通过位点特异性诱变方法将目标突变引入DNA的靶位点中。位点特异性诱变方法的实例可以包括使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCRTechnology,Erlich,H.A.编,StocktonPress(1989);CarterP.,Meth.InEnzymol.,154,382(1987));以及使用噬菌体的方法(Kramer,W.andFrits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A.etal.,Meth.inEnzymol.,154,367(1987))。可以通过例如在SAM存在下将酶与底物,诸如原儿茶酸或原儿茶醛温育并测量相应产物,诸如香草酸或香草醛的酶和底物依赖性产生来测量OMT活性(WO2013/022881A1)。此外,通过在相同条件下测量相应副产物,诸如异香草酸或异香草醛的产生,并将副产物的产生与产物的产生进行比较,可以确定OMT是否选择性地生成产物。术语“芳族醛氧化还原酶(芳族羧酸还原酶;ACAR)”可以指具有催化在电子供体和ATP存在下还原香草酸和/或原儿茶酸的反应以产生香草醛和/或原儿茶醛的活性的蛋白质(EC1.2.99.6等)。此活性也可以称为“ACAR活性”。编码ACAR的基因也可称为“ACAR基因”。ACAR通常可以使用香草酸和原儿茶酸两者作为底物,但不必限于此。也就是说,ACAR可以具有需要的底物特异性,这取决于在如本文所述的方法中生产目标物质的特定生物合成途径。例如,当通过香草酸向香草醛的转化来生产目标物质时,可以使用至少对香草酸特异性的ACAR。另外,例如,当通过原儿茶酸向原儿茶醛的转化来生产目标物质时,可以使用至少对原儿茶酸特异性的ACAR。电子供体的实例可以包括NADH和NADPH。ACAR的实例可以包括各种生物体如诺卡尔菌属种(Nocardiasp.)菌株NRRL5646、放线菌属种(Actinomycessp.)、热乙酸梭菌(Clostridiumthermoaceticum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、甜瓜棒孢(Corynesporamelonis)、云芝属种(Coriolussp.)和链孢霉属种(Neurosporasp.)天然的ACAR(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。诺卡尔菌属种菌株NRRL5646已被分类为艾阿华诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)。ACAR的实例还可包括其他诺卡氏菌细菌,例如巴西诺卡氏菌(Nocardiabrasiliensis)和伤口诺卡氏菌(Nocardiavulneris)的ACAR。巴西诺卡氏菌ATCC700358天然的ACAR基因的核苷酸序列以SEQIDNO:17显示,并且由此基因编码的ACAR的氨基酸序列以SEQIDNO:18显示。巴西诺卡氏菌ATCC700358天然的变体ACAR基因的实例的核苷酸序列以SEQIDNO:19显示,并且由此基因编码的ACAR的氨基酸序列以SEQIDNO:20显示。ACAR活性可以通过例如在ATP和NADPH存在下将酶与底物,诸如香草酸或原儿茶酸一起温育,并且测量NADPH的酶和底物依赖性氧化来测量(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485中描述的方法的修改)。可以通过磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)将ACAR变为活性酶(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。因此,ACAR活性也可以通过增加催化蛋白质的磷酸泛酰巯基乙胺化的酶(其也可以称为“磷酸泛酰巯基乙胺基化酶”)的活性来增加。也就是说,赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例可以包括增加磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的活性的方法。也就是说,微生物可以以使磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的活性得以增加的方式进行了修饰。磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的实例可以包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。术语“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)”可以指具有在磷酸泛酰巯基乙胺基供体存在下催化使ACAR磷酸泛酰巯基乙胺化的反应的活性的蛋白质。此活性也可以称为“PPT活性”。编码PPT的基因也可以称为“PPT基因”。磷酸泛酰巯基乙胺基供体的实例可以包括辅酶A(CoA)。PPT的实例可以包括EntD蛋白,其由entD基因编码。PPT例如EntD蛋白质的实例可以包括各种生物体天然的那些。PPT的具体实例可以包括大肠杆菌天然的EntD蛋白。大肠杆菌K-12MG1655菌株的entD基因的核苷酸序列如SEQIDNO:21所示,并且由该基因编码的EntD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示。PPT的具体实例还可以包括巴西诺卡菌天然的PPT,皮疽诺卡菌(Nocardiafarcinica)IFM10152天然的PPT(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)和谷氨酸棒杆菌天然的PPT(App.Env.Microbiol.2009,Vol.75,No.9,pp.2765-2774)。谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天然的PPT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示,并且由该基因编码的PPT的氨基酸序列如SEQIDNO:24所示。PPT活性可以基于例如在CoA存在下与ACAR温育时观察到的ACAR活性的增强来测量(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。褪黑激素可以从L-色氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括例如L-色氨酸生物合成酶和催化L-色氨酸转化成褪黑激素的酶。L-色氨酸生物合成酶的实例可以包括芳香族氨基酸的常见生物合成酶,例如3-脱氧-D-阿拉伯糖庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF,aroG,aroH),3-脱氢喹啉合酶(aroB),3-脱氢喹啉脱水酶(aroD),莽草酸脱氢酶(aroE),莽草酸激酶(aroK,aroL),5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)和分支酸合酶(aroC);以及邻氨基苯甲酸合酶(trpED)和色氨酸合酶(trpAB)。在酶的名称之后的括号中显示了编码酶的基因的名称的实例(这在下文也适用于相同的情况)。通过色氨酸5-羟化酶(EC1.14.16.4),5-羟色氨酸脱羧酶(EC4.1.1.28),芳烷基胺N-乙酰转移酶(AANAT;EC2.3.1.87)和乙酰血清素O-甲基转移酶(EC2.1.1.4)的作用,L-色氨酸可以依次转化为羟色氨酸,5-羟色胺,N-乙酰血清素和褪黑激素。也就是说,催化L-色氨酸转化为褪黑激素的酶的实例可以包括这些酶。值得注意的是,乙酰血清素O-甲基转移酶是OMT的一个实例,其催化使用SAM作为甲基供体使N-乙酰血清素甲基化以产生褪黑激素的反应。麦角硫因可以从L-组氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括例如L-组氨酸生物合成酶和催化L-组氨酸转化为麦角硫因的酶。L-组氨酸生物合成酶的实例可以包括ATP磷酸核糖基转移酶(hisG),磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisI),磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisI),磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamideribotideisomerase)(hisA),氨基转移酶(hisH),磷酸组氨醇氨基转移酶(hisC),组氨醇磷酸酶(hisB)和组氨醇脱氢酶(hisD)。L-组氨酸可以通过分别由egtB、egtC、egtD和egtE基因编码的EgtB、EgtC、EgtD和EgtE蛋白的作用连续转化为组氨酸三甲基内盐(hercynine),hercynyl-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸亚砜,hercynyl-L-半胱氨酸亚砜和麦角硫因。组氨酸三甲基内盐还可以通过由egt1基因编码的Egt1蛋白的作用转化为hercynyl-L-半胱氨酸亚砜。也就是说,催化L-组氨酸转化为麦角硫因的酶的实例可以包括这些酶。值得注意的是,EgtD是S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)依赖性组氨酸N,N,N-甲基转移酶,其催化使用SAM作为甲基供体使组氨酸甲基化以产生组氨酸三甲基内盐的反应。愈创木酚可以从香草酸生产。因此,上述关于香草酸的目标物质生物合成酶的描述可以在必要修饰后适用于愈创木酚的目标物质生物合成酶。香草酸可以通过香草酸脱羧酶(VDC)的作用转化为愈创木酚。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括VDC。阿魏酸、4-乙烯基愈创木酚和4-乙基愈创木酚可以从L-苯丙氨酸或L-酪氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括例如L-苯丙氨酸生物合成酶,L-酪氨酸生物合成酶,以及催化L-苯丙氨酸或L-酪氨酸转化为阿魏酸,4-乙烯基愈创木酚或4-乙基愈创木酚的酶。L-苯丙氨酸生物合成酶的实例可包括上文例示的芳香族氨基酸的常见生物合成酶,以及分支酸变位酶(pheA),预苯酸脱水酶(pheA)和酪氨酸氨基转移酶(tyrB)。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶可以由pheA基因编码为双功能酶。L-酪氨酸生物合成酶的实例可以包括上文例示的芳香族氨基酸的常见生物合成酶,以及分支酸变位酶(tyrA),预苯酸脱氢酶(tyrA)和酪氨酸氨基转移酶(tyrB)。分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶可以由tyrA基因编码为双功能酶。L-苯丙氨酸可以通过苯丙氨酸脱氨酶(PAL;EC4.3.1.24)的作用转化为肉桂酸,然后通过肉桂酸4-羟化酶(C4H;EC1.14.13.11)的作用转化为对香豆酸。此外,L-酪氨酸可通过酪氨酸脱氨酶(TAL;EC4.3.1.23)的作用转化为对香豆酸。对香豆酸可以分别通过羟基肉桂酸3-羟化酶(C3H),O-甲基转移酶(OMT),阿魏酸脱羧酶(FDC)和乙烯基苯酚还原酶(VPR)的作用连续转化为咖啡酸,阿魏酸,4-乙烯基愈创木酚和4-乙基愈创木酚。也就是说,催化L-苯丙氨酸或L-酪氨酸转化为阿魏酸,4-乙烯基愈创木酚或4-乙基愈创木酚的酶的实例可以包括这些酶。为了生产阿魏酸,4-乙烯基愈创木酚或4-乙基愈创木酚,可以使用至少使用咖啡酸的OMT。多胺可以从L-精氨酸或L-鸟氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可包括,例如,L-精氨酸生物合成酶,L-鸟氨酸生物合成酶,以及催化L-精氨酸或L-鸟氨酸转化为多胺的酶。L-鸟氨酸生物合成酶的实例可包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA),N-乙酰谷氨酸激酶(argB),N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC),乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)和乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)。L-精氨酸生物合成酶的实例可包括上文例示的L-鸟氨酸生物合成酶,以及氨甲酰磷酸合成酶(carAB),鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF,argI),精氨琥珀酸合成酶(argG),精氨基琥珀酸裂合酶(argH)。L-精氨酸可以通过精氨酸脱羧酶(speA;EC4.1.1.19)的作用转化为胍丁胺,然后通过胍丁胺尿素水解酶(speA;EC4.1.1.19)的作用转化为腐胺。此外,L-鸟氨酸可以通过鸟氨酸脱羧酶(speC;EC4.1.1.17)的作用转化为腐胺。腐胺可以通过亚精胺合酶(speE;EC2.5.1.16)的作用转化为亚精胺,然后通过精胺合成酶(EC2.5.1.22)的作用转化为精胺。胍丁胺也可以通过胍丁胺/三胺氨基丙基转移酶的作用转化为氨基丙基胍丁胺,然后通过氨基丙基胍丁胺尿素水解酶的作用转化为亚精胺。也就是说,催化L-精氨酸或L-鸟氨酸转化为多胺的酶的实例可以包括这些酶。值得注意的是,亚精胺合酶,精胺合成酶和胍丁胺/三胺氨基丙基转移酶各自催化将来自脱羧的S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)(其可以通过脱羧作用从SAM产生)的丙胺基团转移到相应的底物中的反应。肌酸可以从L-精氨酸和甘氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括例如L-精氨酸生物合成酶,甘氨酸生物合成酶和催化L-精氨酸和甘氨酸转化成肌酸的酶。可以将L-精氨酸和甘氨酸组合以通过精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT,EC2.1.4.1)的作用产生胍基乙酸(guanidinoacetate)和鸟氨酸;使用SAM作为甲基供体,可以通过胍基乙酸N-甲基转移酶(GAMT,EC2.1.1.2)的作用使胍基乙酸甲基化以生成肌酸。也就是说,催化L-精氨酸和甘氨酸转化为肌酸的酶的实例可包括这些酶。麦根酸可以从SAM生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可以包括例如催化SAM转化为麦根酸的酶。可以通过烟草胺(nicotianamine)合酶(EC2.5.1.43)的作用从三个SAM分子合成一个烟草胺分子。烟草胺可以通过烟草胺转氨酶(EC2.6.1.80)、3"-脱氨基-3"-氧烟草胺(oxonicotianamine)还原酶(EC1.1.1.285)和2'-脱氧麦根酸2'-双加氧酶(EC1.14.11.24)的作用连续转化为3"-脱氨基-3"-氧烟草胺、2'-脱氧麦根酸和麦根酸。也就是说,催化SAM转化为麦根酸的酶的实例可以包括这些酶。L-甲硫氨酸可以从L-半胱氨酸生产。也就是说,目标物质生物合成酶的实例还可包括,例如,L-半胱氨酸生物合成酶和催化L-半胱氨酸转化为L-甲硫氨酸的酶。L-半胱氨酸生物合成酶的实例可包括本文中描述的CysIXHDNYZ蛋白、Fpr2蛋白和CysK蛋白码。催化L-半胱氨酸转化为L-甲硫氨酸的酶的实例可包括胱硫醚-γ-合酶和胱硫醚-β-裂合酶。用于赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例还可以包括提高目标物质以外物质,例如在生产目标物质期间作为中间产物生成的物质和用作目标物质前体的物质的摄取系统的活性的方法。也就是说,本发明的细菌可以以使此类摄取系统的活性得以增加的方式进行了修饰。术语“物质的摄取系统”可以指具有将来自细胞外部的物质掺入细胞的功能的蛋白质。此活性也可以称为“物质的摄取活性”。编码此类摄取系统的基因也可以称为“摄取系统基因”。此类摄取系统的实例可以包括香草酸摄取系统和原儿茶酸摄取系统。香草酸摄取系统的实例可以包括由vanK基因编码的VanK蛋白(M.T.Chaudhry,etal.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的vanK基因(NCgl2302)的核苷酸序列如SEQIDNO:25所示,并且由该基因编码的VanK蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:26所示。原儿茶酸摄取系统基因可以包括由pcaK基因编码的PcaK蛋白(M.T.Chaudhry,etal.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的pcaK基因(NCgl1031)的核苷酸序列如SEQIDNO:27所示,并且由该基因编码的PcaK蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:28所示。可以根据例如已知方法(M.T.Chaudhry,etal.,Microbiology,2007.153:857-865)测量物质的摄取活性。用于赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例还可以包括降低参与目标物质以外的物质的副生成的酶的活性的方法。除了目标物质以外的此类物质也可以称为“副产物”。此类酶也可以称为“副产物生成酶”。副产物生成酶的实例可以包括例如参与目标物质利用的酶和催化远离目标物质的生物合成途径分支的反应以产生除目标物质之外的物质的酶。本文描述了降低蛋白质诸如酶等的活性的方法。通过例如破坏编码蛋白质的基因可以降低蛋白质诸如酶等的活性。例如,据报道,在棒状杆菌细菌中,香草醛按香草醛->香草酸->原儿茶酸的顺序代谢并利用(CurrentMicrobiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。也就是说,副产物生成酶的具体实例可以包括催化香草醛转化为原儿茶酸的酶和催化原儿茶酸进一步代谢的酶。此类酶的实例可以包括香草酸脱甲基酶,原儿茶酸3,4-双加氧酶,以及将原儿茶酸3,4-双加氧酶的反应产物进一步分解为琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的各种酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。此外,可以通过醇脱氢酶的作用将香草醛转化成香草醇(KunjapurAM.etal.,J.Am.Chem.Soc.,2014,Vol.136,p11644-11654.;HansenEH.etal.,App.Env.Microbiol.,2009,Vol.75,p2765-2774.)。也就是说,副产物生成酶的具体实例也可以包括醇脱氢酶(ADH)。此外,作为香草酸和香草醛生物合成途径中间体的3-脱氢莽草酸也可以通过莽草酸脱氢酶的作用转化为莽草酸。也就是说,副产物生成酶的具体实例还可以包括莽草酸脱氢酶。术语“香草酸脱甲基酶”可以指具有催化香草酸脱甲基化生成原儿茶酸的反应的活性的蛋白质。此活性也可以称为“香草酸脱甲基酶活性”。编码香草酸脱甲基酶的基因也可以称为“香草酸脱甲基酶基因”。香草酸脱甲基酶的实例可以包括由vanAB基因编码的VanAB蛋白(CurrentMicrobiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。vanA基因和vanB基因分别编码香草酸脱甲基酶的亚基A和亚基B。为了降低香草酸脱甲基酶活性,这两种vanAB基因可以被破坏等,或者两者中仅一种可以被破坏等。谷氨酸棒杆菌ATCC13869天然菌株的vanAB基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:29和31所示,并且由这些基因编码的VanAB蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO:30和32所示。vanAB基因通常与vanK基因一起构成vanABK操纵子。因此,为了降低香草酸脱甲基酶活性,vanABK操纵子可以被完全破坏等(例如缺失)。在此类情况下,可以将vanK基因再引入宿主。例如,当使用存在于细胞外的香草酸,并且vanABK操纵子完全被破坏等(例如缺失)时,优选再引入vanK基因。香草酸脱甲基酶活性可以通过例如将酶与底物诸如香草酸温育并测量原儿茶酸的酶和底物依赖性产生来测量(JBacteriol,2001,Vol.183,p3276-3281)。术语“原儿茶酸3,4-双加氧酶”可以指具有催化氧化原儿茶酸反应生成β-羧基-顺,顺-粘康酸的反应活性的蛋白质。此活性也可以称为“原儿茶酸3,4-双加氧酶活性”。编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的基因也可以称为“原儿茶酸3,4-双加氧酶基因”。原儿茶酸3,4-双加氧酶的实例可以包括由pcaGH基因编码的PcaGH蛋白(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。pcaG基因和pcaH基因分别编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的α亚基和β亚基。为了降低原儿茶酸3,4-双加氧酶活性,这两种pcaGH基因可以被破坏等,或者两者中仅一种可以被破坏等。谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天然的pcaGH基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:33和35所示,并且由这些基因编码的PcaGH蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO:34和36所示。原儿茶酸3,4-双加氧酶活性可以通过例如将酶与底物诸如原儿茶酸温育并测量酶和底物依赖性氧消耗量来测量(Meth.Enz.,1970,Vol.17A,p526-529)。术语“醇脱氢酶(ADH)”可以指具有在电子供体存在下催化醛还原以产生醇的反应的活性的蛋白质(EC1.1.1.1,EC1.1.1.2,EC1.1.1.71等)。此活性也可以称为“ADH活性”。编码ADH的基因也可以称为“ADH基因”。电子供体的实例可以包括NADH和NADPH。作为ADH,具有在电子供体存在下催化还原香草醛的反应以产生香草醇的活性的ADH是一个特别的例子。该活性也可以特别称为“香草醇脱氢酶活性”。此外,具有香草醇脱氢酶活性的ADH也可以特别称为“香草醇脱氢酶”。作为ADH,具有催化在电子供体存在下还原香草醛以产生香草醇的反应的活性的ADH是具体的实例。此活性也可以特别称为“香草醇脱氢酶活性”。此外,具有香草醇脱氢酶活性的ADH也可以特别称为“香草醇脱氢酶”。ADH的实例可以包括分别由yqhD基因,NCgl0324基因,NCgl0313基因,NCgl2709基因,NCgl0219基因和NCgl2382基因编码的YqhD蛋白,NCgl0324蛋白质,NCgl0313蛋白质,NCgl2709蛋白质,NCgl0219蛋白质和NCgl2382蛋白质。yqhD基因和NCgl0324基因编码香草醇脱氢酶。yqhD基因可以在例如属于肠杆菌科的细菌,诸如大肠杆菌中找到。NCgl0324基因,NCgl0313基因,NCgl2709基因,NCgl0219基因和NCgl2382基因可以例如在棒状杆菌细菌例如谷氨酸棒杆菌中找到。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的yqhD基因的核苷酸序列如SEQIDNO:37所示,并且由此基因编码的YqhD蛋白的氨基酸序列以SEQIDNO:38所示。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的NCgl0324基因,NCgl0313基因和NCgl2709基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:39,41和43所示,并且由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:40,42和44所示。谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天然的NCgl0219基因和NCgl2382基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:45和47所示,并且由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:46和48所示。可以降低一种ADH的活性,或者可以降低两种或更多种ADH的活性。例如,可以降低诸如NCgl0324蛋白质,NCgl2709蛋白质和NCgl0313蛋白质中的一种或多种的活性。特别地,可以至少降低NCgl0324蛋白质的活性。ADH活性可以通过例如在NADPH或NADH存在下将酶与底物(诸如醛,如香草醛)一起温育,并测量NADPH或NADH的酶和底物依赖性氧化来测量。术语“莽草酸脱氢酶”可以指具有催化在电子供体存在下还原3-脱氢莽草酸以产生莽草酸的反应的活性的蛋白质(EC1.1.1.25)。该活性也可称为“莽草酸脱氢酶活性”。编码莽草酸脱氢酶的基因也可称为“莽草酸脱氢酶基因”。电子供体的实例可包括NADH和NADPH。莽草酸脱氢酶的实例可包括AroE蛋白,其由aroE基因编码。大肠杆菌K-12MG1655菌株天然的aroE基因的核苷酸序列如SEQIDNO:49所示,并且由该基因编码的AroE蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:50所示。莽草酸脱氢酶活性可以通过例如在NADPH或NADH存在下将酶与底物诸如3-脱氢莽草酸一起温育,并测量NADPH或NADH的酶和底物依赖性氧化来测量。用于赋予或增强目标物质生产能力的方法的实例还可以包括增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性的方法。术语“L-半胱氨酸生物合成酶”可以指参与L-半胱氨酸生物合成的蛋白质。编码L-半胱氨酸生物合成酶的基因也可称为“L-半胱氨酸生物合成基因”。L-半胱氨酸生物合成酶的实例可包括参与硫利用的蛋白质。参与硫利用的蛋白质的实例可包括CysIXHDNYZ蛋白质和Fpr2蛋白质,它们分别由cysIXHDNYZ基因和fpr2基因编码。CysIXHDNYZ蛋白特别涉及无机硫化合物如硫酸盐和亚硫酸盐的还原。特别地,Fpr2蛋白可以参与电子转运以还原亚硫酸盐。L-半胱氨酸生物合成酶的实例还可包括O-乙酰丝氨酸(硫醇)-裂合酶。O-乙酰丝氨酸(硫醇)-裂合酶的实例可包括CysK蛋白,其由cysK基因编码。L-半胱氨酸生物合成酶的实例可包括各种生物体,例如肠杆菌科细菌和棒状杆菌细菌天然的那些。L-半胱氨酸生物合成酶的具体实例可包括谷氨酸棒杆菌天然的CysIXHDNYZ蛋白,Fpr2蛋白和CysK蛋白。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的cysIXHDNYZ基因和fpr2基因的核苷酸序列分别以SEQIDNOS:88,90,92,94,96,98,100,和102显示,并且这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别以SEQIDNOS:89,91,93,95,97,99,101和103显示。可以增加一种L-半胱氨酸生物合成酶的活性,或者可以增加两种或更多种L-半胱氨酸生物合成酶的活性。例如,可以增加CysIXHDNYZ蛋白、Fpr2蛋白和CysK蛋白中一种或多种的活性,或者可以增加CysIXHDNYZ蛋白和Fpr2蛋白中一种或多种的活性。L-半胱氨酸生物合成酶的活性可以通过例如增加编码L-半胱氨酸生物合成酶的基因(例如cysIXHDNYZ基因、fpr2基因和cysK基因)的表达来增加。L-半胱氨酸生物合成基因的表达可以通过例如修饰(例如增加或减少)基因表达调节物的活性来增加。也就是说,L-半胱氨酸生物合成基因的表达可以通过例如增加基因的正表达调节物(例如活化剂)的活性来增加。此外,L-半胱氨酸生物合成基因的表达可以通过例如降低基因的负表达调节物(例如阻遏物)的活性来增加。此类调节物也可称为“调节蛋白”。编码此类调节因子的基因也可称为“调节基因”。此类活化剂的实例可包括CysR和SsuR蛋白,它们分别由cysR和ssuR基因编码。CysR蛋白活性的增加可导致cysIXHDNYZ基因,fpr2基因和ssuR基因中一种或多种的表达增加。此外,SsuR蛋白活性的增加可以导致参与有机硫化合物利用的基因表达增加。此类活化剂的实例可包括各种生物体,例如肠杆菌科细菌和棒状杆菌的那些活化剂。此类活化剂的具体实例可包括谷氨酸棒杆菌天然的CysR和SsuR蛋白。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的cysR基因(NCgl0120)和ssuR基因的核苷酸序列分别以SEQIDNO:104和106显示,并且由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别以SEQIDNO:105和107显示。可以增加CysR蛋白和SsuR蛋白中的一种或两种的活性。例如,可以至少增加CysR蛋白的活性。可以通过例如增加编码活化剂的基因的表达来增加此类活化剂的活性。此类阻遏物的实例是McbR蛋白,其由mcbR基因编码。McbR蛋白活性降低可以导致cysR和ssuR基因中一种或多种的表达增加,从而可进一步导致cysIXHDNYZ基因和fpr2基因中一种或多种的表达增加。此类阻遏物的活性可以通过例如降低编码阻遏物的基因的表达或通过破坏编码阻遏物的基因来降低。也就是说,具体地,可以通过例如增加cysIXHDNYZ基因,fpr2基因,cysR基因和ssuR基因中的一种或多种的表达来增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。因此,短语“L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加”可以表示例如cysIXHDNYZ基因,fpr2基因,cysR基因和ssuR基因中的一种或多种的表达得以增加。例如,可以至少增加cysR基因的表达。此外,例如,可以增加所有这些基因的表达。可以通过增加cysR基因的表达来增加cysIXHDNYZ基因,fpr2基因和ssuR基因中一种或多种的表达。用于赋予或增强目标物质生产能力的方法的实例可以进一步包括降低NCgl2048蛋白活性的方法。术语“NCgl2048蛋白”可以指由NCgl2048基因编码的蛋白质。NCgl2048蛋白的实例可以包括各种生物体,诸如肠杆菌科细菌和棒状杆菌细菌天然的蛋白。NCgl2048蛋白的具体实例可以包括谷氨酸棒杆菌天然的NCgl2048蛋白。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的NCgl2048基因的核苷酸序列以SEQIDNO:119显示,并且由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列以SEQIDNO:120显示。顺便提及,关于本文中描述的保守变体,NCgl2048蛋白的原始功能可以指具有以SEQIDNO:120所示的氨基酸序列的蛋白质的功能,或者也可以指微生物中的蛋白质活性降低提供目标物质的生产增加的特性。待修饰活性的蛋白质可以根据产生目标物质的生物合成途径的类型以及选定的微生物中固有存在的蛋白质的类型和活性来适当选择。例如,当通过原儿茶酸的生物转化生产香草醛时,可优选增强OMT,ACAR,PPT和原儿茶酸摄取系统中一种或多种的活性。此外,当通过原儿茶醛生物转化生产香草醛时,可以优选增强OMT的活性。用于育种出具有目标物质生产能力的微生物的基因和蛋白质可以分别具有例如上面列举的或其他已知的核苷酸序列和氨基酸序列。此外,用于育种出具有目标物质生产能力的微生物的基因和蛋白质可以是上面例示的基因和蛋白质的保守变体,例如分别具有上述例示或其他已知核苷酸序列和氨基酸序列的基因和蛋白质。具体地,例如,用于育种出具有目标物质生产能力的微生物的基因可以各自是编码蛋白质的基因,所述蛋白质具有上述例示的氨基酸序列或已知蛋白质的氨基酸序列但可以包含一个或几个位置处一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加,只要保持蛋白质的原始功能,即其酶活性,转运蛋白活性等即可。对于基因和蛋白质的保守变体,可以在必要修改后适用关于本文描述的烯醇化酶基因和烯醇化酶的保守变体的描述。<1-2>烯醇化酶活性的降低微生物可以以烯醇化酶活性得以降低的方式进行修饰。具体地,微生物可以以与未修饰的菌株相比烯醇化酶活性得以降低的方式进行修饰。通过以烯醇化酶活性得以降低的方式修饰微生物,可以改善微生物的目标物质生产能力,并且也就是说,可以增加通过使用微生物的目标物质生产。此外,通过以烯醇化酶活性得以降低的方式修饰微生物,可能改善微生物生成或再生SAM的能力。也就是说,具体地,微生物的目标物质生产能力的增加可以是由于微生物生成或再生SAM的能力增加所致。可以通过以烯醇化酶活性得以降低的方式修饰具有目标物质生产能力的微生物获得如本文中所述的微生物。也可以通过以烯醇化酶活性得以降低的方式修饰微生物,然后对微生物赋予目标物质生产能力或增强微生物的目标物质生产能力来获得微生物。另外,由于降低烯醇化酶活性的修饰,或者由于降低烯醇化酶活性的修饰和赋予或增强目标物质生产能力的其他修饰的组合,微生物可以已经获得了目标物质生产能力。可以以任意顺序进行构建微生物的修饰。术语“烯醇化酶”可以指具有催化将2-磷酸-D-甘油酸脱水以生成磷酸烯醇丙酮酸的反应的活性的蛋白质(EC4.2.1.11)。此活性也可以称为“烯醇化酶活性”。烯醇化酶也可以称为“磷酸丙酮酸水合酶”。编码烯醇化酶的基因也可以称为“烯醇化酶基因”。烯醇化酶的实例可以包括Eno蛋白,其由eno基因编码。烯醇化酶诸如Eno蛋白的实例可以包括各种生物体,诸如肠杆菌科细菌和棒状杆菌细菌天然的蛋白。烯醇化酶的具体实例可以包括谷氨酸棒杆菌天然的Eno蛋白。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株天然的eno基因(NCgl0935)的核苷酸序列以SEQIDNO:128显示,并且由此蛋白质编码的Eno蛋白的氨基酸序列以SEQIDNO:129显示。也就是说,烯醇化酶基因可以是例如具有以SEQIDNO:128所示的核苷酸序列的基因。此外,烯醇化酶可以是例如具有以SEQIDNO:129所示的氨基酸序列的蛋白质。表述“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”涵盖当基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列时,以及当基因或蛋白质仅包含核苷酸或氨基酸序列时。烯醇化酶基因可以是上文例示的任何烯醇化酶基因(即eno基因)的变体,只要保持其原始功能即可。类似地,烯醇化酶可以是上文例示的任何烯醇化酶(诸如Eno蛋白)的变体,只要保持其原始功能即可。保持其原始功能的变体也可以称为“保守变体”。用上述基因名称定义的基因和用上述蛋白质名称定义的蛋白质不仅可以分别包括上面例示的基因和蛋白质,还可以包括其保守变体。也就是说,例如,术语“eno基因或NCgl0935基因”不仅可以包括上面例示的eno基因,例如具有以SEQIDNO:128所示核苷酸序列的eno基因,还可以包括其保守变体。类似地,术语“Eno蛋白或NCgl0935蛋白”不仅可包括上文例示的Eno蛋白,例如具有以SEQIDNO:129所示的氨基酸序列的Eno蛋白,还可包括其保守变体。保守变体的实例可包括例如上文例示的基因和蛋白质的同源物和人工修饰形式。表述“保持原始功能”指基因或蛋白质的变体具有对应于原始基因或蛋白质的功能(例如活性或性质)的功能(例如活性或性质)。当提到基因时,表述“保持原始功能”指该基因的变体编码保持原始功能的蛋白质。也就是说,当提及烯醇化酶基因时,表述“保持原始功能”指基因的变体编码烯醇化酶。当提及参与烯醇化酶时,表述“保持原始功能”指蛋白质的变体具有烯醇化酶活性。烯醇化酶活性可以通过将酶与底物诸如2-磷酸-D-甘油酸一起温育,并且测量磷酸烯醇丙酮酸的酶和底物依赖性生成来测量。以下将解释保守变体的实例。烯醇化酶基因同源物或烯醇化酶同源物可以使用上述例示的烯醇化酶基因的任何核苷酸序列或上文例示的烯醇化酶的任何氨基酸序列作为查询序列通过例如BLAST搜索或FASTA搜索从公共数据库容易地获得。此外,烯醇化酶基因的同源物可以通过例如使用棒状杆菌细菌等生物体的染色体作为模板和基于上述例示的烯醇化酶基因的任何核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物的PCR获得。烯醇化酶基因基因可以编码蛋白质,所述蛋白质具有任何上述氨基酸序列如以SEQIDNO:129所示的氨基酸序列,且包括在一个或几个位置处一个或几个氨基酸残基的取代,缺失,插入和/或添加,只要保持原始功能即可。例如,编码的蛋白质可以具有延伸的或缺失的N端和/或C端。尽管以上使用的术语“一个或几个”所表示的数目可以随蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同,具体而言,它例如为1至50,1至40,1至30,1至20,1至10,1至5,或1至3。一个或几个氨基酸残基的上述取代,缺失,插入和/或添加可以各自是保持蛋白质原始功能的保守突变。保守突变的典型实例是保守取代。若取代位点是芳香氨基酸,则保守取代是其中取代在Phe,Trp和Tyr之间相互发生的突变;若它是疏水性氨基酸,则保守取代是取代在Leu,Ile和Val之间相互发生的突变;若它是极性氨基酸;则保守取代是取代在Gln和Asn之间相互发生的突变;若它是碱性氨基酸,则保守取代是取代在Lys,Arg和His之间相互发生的突变;若它是酸性氨基酸,则保守取代是取代在Asp和Glu之间相互发生的突变;以及若它是具有羟基的氨基酸,则保守取代是取代在Ser和Thr之间相互发生的突变。认为是保守取代的取代的实例可以具体包括用Ser或Thr取代Ala,用Gln,His,或Lys取代Arg,用Glu,Gln,Lys,His,或Asp取代Asn,用Asn,Glu,或Gln取代Asp,用Ser或Ala取代Cys,用Asn,Glu,Lys,His,Asp,或Arg取代Gln,用Gly,Asn,Gln,Lys,或Asp取代Glu,用Pro取代Gly,用Asn,Lys,Gln,Arg,或Tyr取代His,用Leu,Met,Val,或Phe取代Ile,用Ile,Met,Val,或用Phe取代Leu,用Asn,Glu,Gln,His,或Arg取代Lys,用Ile,Leu,Val,或Phe取代Met,用Trp,Tyr,Met,Ile,或Leu取代Phe,用Thr或Ala取代Ser,用Ser或Ala取代Thr,用Phe或Tyr取代Trp,用His,Phe,或Trp取代Tyr,以及用Met,Ile,或Leu取代Val。此外,如上所述的氨基酸残基的此类取代,缺失,插入,添加等可以包括由于个体差异引起的天然存在的突变或者该基因来源的生物体的物种的差异(突变体或变体)。此外,烯醇化酶基因可以是编码与上述任何氨基酸序列的总氨基酸序列具有例如50%或更多,65%或更多,80%或更多,90%或更多,95%或更多,97%或更多,或99%或更多的同源性的氨基酸序列的蛋白质的基因,只要保持原始功能。另外,在本说明书中,“同源性”等同于“同一性”。此外,烯醇化酶基因可以是能够在严格条件下与可以从任何前述核苷酸序列,如以SEQIDNOS:128所示的核苷酸序列制备的探针,例如与任何上述核苷酸序列的全部序列或部分序列互补的序列杂交的基因(例如DNA),只要保持原始功能。“严格条件”可以指形成所谓特异性杂合物,并且不形成非特异性杂合物的条件。严格条件的实例可以包括高度同源的DNA彼此杂交(例如,不小于50%,65%,或80%同源,不小于90%同源,不小于95%同源,不小于97%同源,或不小于99%同源的DNA彼此杂交,并且同源性小于上述项的DNA不彼此杂交)的那些条件,或典型的Southern杂交的清洗条件,即在与1xSSC,0.1%SDS于60℃;0.1xSSC,0.1%SDS于60℃;或者0.1xSSC,0.1%SDS于68℃对应的盐浓度和温度清洗1次,或2或3次的条件。用于上述杂交的探针可以是与如上述的基因互补的序列的一部分。此类探针可以使用基于已知基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有任何上述基因的DNA片段作为模板通过PCR制备。作为探针,例如可以使用长度约300bp的DNA片段。当使用长度为约300bp的DNA片段作为探针时,具体地,杂交的清洗条件可以是例如50℃,2xSSC和0.1%SDS。此外,由于关于密码子简并性的性质随宿主而变化,烯醇化酶基因可以包括相应等同密码子对任意密码子的替换。也就是说,由于遗传密码的简并性,烯醇化酶基因可以是以上例示的任何烯醇化酶基因的变体。例如,烯醇化酶基因可以以使其根据选择的宿主中的密码子频率而具有最佳密码子的方式进行了修饰的基因。例如,可以通过数学算法来确定两个序列之间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性实例可以包括MyersandMiller(1988)CABIOS4:11-17的算法、Smithetal(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、PearsonandLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的同源性筛选方法和KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法的修改形式,诸如记载于KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877的。通过使用基于此类数学算法的程序,可以进行用于确定序列同一性的序列比较和比对。该程序可以由计算机适当地执行。此类程序的实例可以包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL(可从Intelligenetics,MountainView,Calif.获得),ALIGN程序(版本2.0)以及WisconsinGeneticsSoftwarePackage,版本8(可从GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wis.,USA获得)的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以通过使用例如初始参数来进行。CLUSTAL程序充分记载于Higginsetal.(1988)Gene73:237-244(1988),Higginsetal.(1989)CABIOS5:151-153,Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90,Huangetal.(1992)CABIOS8:155-65,以及Pearsonetal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列,具体而言,例如,可以通过使用BLASTN程序以100的得分和12的字长来进行BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白质同源的氨基酸序列,特别地,例如可以通过以50的得分和3的字长使用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索,参见ncbi.nlm.nih.gov。另外,为了比较目的,可以使用GappedBLAST(BLAST2.0)以获得包含缺口的比对。另外,可以使用PSI-BLAST来进行重复搜索以检测序列之间的远距离关系。关于GappedBLAST和PSI-BLAST,参见Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389。当使用BLAST、GappedBLAST或PSI-BLAST时,可以使用每个程序的初始参数(例如核苷酸序列的BLASTN和氨基酸序列的BLASTX)。比对也可以手动进行。两个序列之间的序列同一性计算为在比对两个序列以便彼此最大限度配合时两个序列中匹配的残基的比率。前述关于基因和蛋白质的保守变体的描述可以在必要修改后应用于任意蛋白质的变体,例如目标物质生物合成酶和编码它们的基因。<1-3>增加蛋白质活性的方法以下,将解释用于增加蛋白质活性的方法。表述“蛋白质的活性得以增加”指与非修饰菌株相比,蛋白质的活性增加。具体而言,表述“蛋白质的活性得以增加”可以意味着与非修饰菌株相比,每细胞的蛋白质的活性增加。术语“非修饰菌株”或“非修饰的微生物的菌株”可以指尚未以增加目标蛋白质活性的方式进行修饰的对照菌株。非修饰菌株的实例可以包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例可以包括微生物物种的相应类型菌株。非修饰菌株的具体实例还可以包括以上关于微生物描述所例示的菌株。也就是说,在一个实施方案中,与类型菌株,即微生物所属的物种的类型菌株相比,蛋白质的活性可以得以增加。在另一个实施方案中,与谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株相比,蛋白质的活性也可以得以增加。在另一个实施方案中,与谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株相比,蛋白质的活性也可以得以增加。在另一个实施方案中,与大肠杆菌K-12MG1655菌株相比,蛋白质的活性也可以得以增加。“蛋白质活性得以增加”的短语也可以表达为“蛋白质的活性得以增强”。更具体地说,表述“蛋白质的活性得以增加”可以意味着与非修饰菌株相比每细胞的蛋白质的分子数目增加,和/或蛋白质的每个分子的功能增加。也就是说,表述“蛋白质活性得以增加”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性,而且还可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量),或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。此外,“蛋白质的活性得以增加”的短语不仅包括当目标蛋白质的活性在固有具有目标蛋白质活性的菌株中增加时,而且还包括当将目标蛋白质的活性赋予不固有地具有目标蛋白质活性的菌株时。此外,只要蛋白质的活性最终得以增加,宿主中固有存在的目标蛋白质的活性可以弱化和/或消除,然后可以将适当类型的目标蛋白质赋予宿主。蛋白质活性增加的程度不受特别限制,只要蛋白质的活性与非修饰菌株相比增加即可。蛋白质的活性可以增加至例如非修饰菌株的蛋白质活性的1.2倍以上,1.5倍以上,2倍以上,或3倍以上。此外,当非修饰菌株不具有目标蛋白质的活性时,足够的是由于引入编码蛋白质的基因而产生蛋白质,并且例如,蛋白质可以以使其活性可以得到测量的程度生产。提高蛋白质活性的修饰可以通过例如增加编码该蛋白质的基因的表达来实现。短语“基因的表达得以增加”意指与非修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比,基因的表达得以增加。具体而言,短语“基因表达得以增加”可以意味着每个细胞的基因表达量与非修饰菌株相比得以增加。更具体地,短语“基因表达得以增加”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)得以增加,和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质量)得以增加。“基因表达得以增加”的短语也称为“基因表达得以增强”。基因的表达可以增加至例如非修饰菌株的表达的1.2倍以上,1.5倍以上,2倍以上,或3倍以上。此外,“基因表达得以增加”的短语不仅可以包括当目标基因的表达量在固有表达目标基因的菌株中得以增加时,而且还包括当将基因引入到不固有地表达目标基因并在其中表达的菌株中时。也就是说,短语“基因表达得以增加”也可以意指例如,将目标基因引入不拥有该基因的菌株中并在其中表达。例如,可以通过增加基因的拷贝数来增加基因的表达。可以通过将基因引入宿主的染色体来增加基因的拷贝数。例如可以通过使用同源重组(Miller,J.H.,ExperimentsinMolecularGenetics,1972,ColdSpringHarborLaboratory)将基因引入染色体。使用同源重组的基因转移方法的实例可以包括使用线性DNA的方法,诸如Red驱动的整合(Datsenko,K.A.,andWanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000)),使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法,使用能够接合转移的质粒的方法,使用不具有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法,使用噬菌体的转导方法。可以引入基因的仅一个拷贝,或可以引入基因的两个或更多个拷贝。例如,通过使用以染色体上的多个拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组,可以将多个拷贝的基因引入染色体。以多个拷贝存在于染色体上的此类序列的实例可以包括重复DNA和位于转座子两端的反向重复序列。或者,可以通过使用染色体上的适当序列,如对于产生目标物质不必要的基因作为靶标进行同源重组。另外,也可以用转座子或Mini-Mu(日本专利公开(Kokai)No.2-109985,美国专利No.5,882,888,EP805867B1)将基因随机引入染色体。可以通过使用具有与全部基因或其一部分互补的序列的探针进行Southern杂交、使用基于该基因序列制备的引物的PCR等确认靶基因对染色体的引入。此外,通过将含有该基因的载体引入宿主中,也可以增加基因的拷贝数。例如,通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中起作用的载体连接以构建该基因的表达载体,并用该表达载体转化宿主,可以增加靶基因的拷贝数。可以通过例如使用具有靶基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR获得含有靶基因的DNA片段。作为载体,可以使用宿主细胞中可自主复制的载体。该载体可以是多拷贝载体。此外,载体可以具有用于选择转化体的标志物如抗生素抗性基因。此外,载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如源自细菌质粒的载体,源自酵母质粒的载体,源自噬菌体的载体,粘粒,噬菌粒等。可在肠杆菌科细菌诸如大肠杆菌中自主复制的载体的具体实例可以包括例如pUC19,pUC18,pHSG299,pHSG399,pHSG398,pBR322,pSTV29(所有这些可购自TakaraBio),pACYC184,pMW219(NIPPONGENE),pTrc99A(Pharmacia),pPROK系列载体(Clontech),pKK233-2(Clontech),pET系列载体(Novagen),pQE系列载体(QIAGEN),pColdTFDNA(TaKaRa),pACYC系列载体,和宽宿主范围的载体RSF1010。可在棒状杆菌细菌中自主复制的载体的具体实例可以包括例如pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));通过改善这些质粒获得并具有药物抗性基因的质粒;日本专利公开(Kokai)No.3-210184中描述的质粒pCRY30;日本专利公开(Kokai)No.2-72876和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21,pCRY2KE,pCRY2KX,pCRY31,pCRY3KE和pCRY3KX;日本专利公开(Kokai)No.1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3;日本专利公开(Kokai)No.58-192900中描述的pAJ655,pAJ611和pAJ1844;日本专利公开(Kokai)No.57-134500中描述的pCG1;日本专利公开(Kokai)No.58-35197中描述的pCG2;日本专利公开(Kokai)No.57-183799中描述的pCG4和pCG11;日本专利公开(Kokai)No.10-215883中描述的pVK7;WO2007/046389中描述的pVK9;WO2013/069634中描述的pVS7;和日本专利公开(Kokai)No.9-070291中描述的pVC7。当引入基因时,宿主可以表达基因是足够的。具体而言,宿主中存在基因以便其在宿主中起作用的启动子的控制下表达是足够的。术语“在宿主中起作用的启动子”可以指在宿主中显示启动子活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子或异源启动子。启动子可以是待引入基因的天然启动子或另一基因的启动子。作为启动子,例如也可以使用如本文描述的更强的启动子。终止基因转录的终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制,只要其在选择的宿主中起作用。终止子可以是源自宿主的终止子或异源终止子。终止子可以是待引入基因的天然终止子或另一基因的终止子。终止子的具体实例可以包括例如T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。在“FundamentalMicrobiologyVol.8,GeneticEngineering,KYORITSUSHUPPANCO.,LTD,1987”中详细公开了可用于各种微生物中的载体,启动子和终止子,并且可以使用那些。此外,当引入两个或更多个基因时,基因各自可以由宿主表达是足够的。例如,所有基因可以由单个表达载体或染色体携带。此外,基因可以分别由两个或更多个表达载体携带,或者分开由单一或两个或更多个表达载体和染色体携带。也可以引入由两个或更多个基因构成的操纵子。“引入2个或更多个基因”的短语可以指例如引入编码2种或更多种蛋白质(酶等)的相应基因,引入编码构成单一蛋白质复合物(例如酶复合物)的2种或更多种亚基的相应基因以及它们的组合。待引入的基因没有特别限制,只要它编码在宿主中起作用的蛋白即可。待引入的基因可以是源自宿主的基因,或者可以是异源基因。可以例如使用基于该基因的核苷酸序列设计的引物,并使用具有该基因的生物体的基因组DNA,携带该基因的质粒等作为模板通过PCR获得待引入的基因。待引入的基因也可以完全合成,例如基于该基因的核苷酸序列(Gene,60(1),115-127(1987))。获得的基因可以原样使用,或者根据需要在修饰后使用。也就是说,可以通过修饰基因来获得基因的变体。基因可以通过已知技术进行修饰。例如,可以通过位点特异性突变方法将目标突变引入DNA的目标位点。也就是说,可以通过位点特异性突变方法修饰基因的编码区,使得编码蛋白的特定位点包括氨基酸残基的取代,缺失,插入和/或添加。位点特异性突变方法的实例可以包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCRTechnology,Erlich,H.A.Eds.,StocktonPress(1989);Carter,P.,Meth.inEnzymol.,154,382(1987))和利用噬菌体的方法(Kramer,W.andFrits,H.J.,Meth.于Enzymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A.etal.,Meth.inEnzymol.,154,367(1987))。或者,可以完全合成基因的变体。另外,当蛋白质作为由多个亚基构成的复合物起作用时,可以修饰多个亚基的部分或全部,只要蛋白质的活性最终得以增加。也就是说,例如,当通过增加基因的表达来增加蛋白质的活性时,可以增强编码亚基的多个基因的部分或全部的表达。通常优选增强编码亚基的多个基因全部的表达。此外,构成该复合物的亚基可以源自单一种类的生物体或两种或更多种生物体,只要该复合物具有目标蛋白质的功能即可。也就是说,例如,可以将编码多个亚基的相同生物体的基因引入宿主,或者可以将编码多个亚基的不同生物体的基因引入宿主中。此外,可以通过改善基因的转录效率增加基因的表达。另外,通过提高基因的翻译效率也可以增加基因的表达。基因的转录效率和基因的翻译效率可以通过例如修饰基因的表达控制序列来改善。术语“表达控制序列”可以共同指影响基因表达的位点。表达控制序列的实例可以包括例如启动子,Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以称为核糖体结合位点(RBS))和RBS与起始密码子之间的间隔物区。可以通过使用启动子搜索载体或基因分析软件如GENETYX来鉴定表达控制序列。这些表达调控序列可以通过例如使用温度敏感性载体的方法或Red驱动整合方法(WO2005/010175)进行修饰。通过例如用更强的启动子替换染色体上的基因的启动子可以提高基因的转录效率。术语“更强的启动子”可以指与基因的固有的野生型启动子相比提供改善的基因转录的启动子。更强的启动子的实例可以包括例如已知的高表达启动子,诸如T7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、msrA启动子、Pm1启动子(源自双歧杆菌属(Bifidobacterium))、PR启动子和PL启动子。在棒状杆菌细菌中可用的更强启动子的实例可以包括例如在棒状杆菌细菌中用乙酸、乙醇、丙酮酸等可诱导的人工修饰的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)),pta,aceA,aceB,adh,和amyE启动子,cspB,SOD和tuf(EF-Tu)启动子,它们是能够在棒状杆菌细菌中提供大表达量的有力启动子(JournalofBiotechnology,104(2003)311-323;Appl.Environ.Microbiol.,2005Dec;71(12):8587-96),P2启动子(SEQIDNO:108的位置942-1034)和P3启动子(SEQIDNO:111)以及lac启动子,tac启动子和trc启动子。此外,作为更强的启动子,通过使用各种报道基因也可以获得高活性类型的现有启动子。例如,通过使启动子区中的-35和-10区更接近共有序列,可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性型启动子的实例可以包括各种tac样启动子(KatashkinaJIetal.,RussianFederationPatentApplicationNo.2006134574)。在Goldsteinetal.(ProkaryoticPromotersinBiotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))的论文等中描述了评估启动子强度的方法和强启动子的实例。例如,通过用更强的SD序列替换染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以称为核糖体结合位点(RBS)),可以改善基因的翻译效率。术语“更强的SD序列”可以指与基因固有的野生型SD序列相比提供改善的mRNA翻译的SD序列。更强的SD序列的实例可以包括例如源自噬菌体T7的基因10的RBS(OlinsP.O.etal,Gene,1988,73,227-235)。此外,已知在RBS和起始密码子之间的间隔物区中,特别是在紧邻起始密码子上游的序列(5'-UTR)中,几个核苷酸的取代,插入或缺失显著影响mRNA的稳定性和翻译效率,因此,也可以通过修饰来改善基因的翻译效率。基因的翻译效率也可以通过例如修饰密码子来改善。例如,通过用更频繁使用的同义密码子取代基因中存在的稀有密码子,可以提高基因的翻译效率。也就是说,例如,基因可以以使该基因含有根据在选择的宿主中观察到的密码子频率的最佳密码子的方式进行了修饰。例如,可以通过用于将目标突变引入DNA的目标位点中的位点特异性突变方法替换密码子。或者,可以完全合成替换目标密码子的基因片段。“密码子选择数据库”(kazusa.or.jp/codon;Nakamura,Y.etal,Nucl.AcidsRes.,28,292(2000))中公开了各种生物体中的密码子的频率。此外,基因的表达还可以通过扩增增加基因表达的调节子或缺失或弱化减少基因表达的调节子来增加。可以独立使用或以任意组合使用如上所述用于增加基因表达的此类方法。此外,也可以通过例如增强酶的比活性来获得增加蛋白质活性的修饰。比活性的增强也可以包括对反馈抑制的脱敏。也就是说,当蛋白质被代谢物反馈抑制时,可以通过使选择的宿主中的基因或蛋白质突变以对反馈抑制脱敏来增加蛋白质的活性。短语“对反馈抑制脱敏”可以包括消除反馈抑制,和弱化反馈抑制,除非另有叙述。此外,“对反馈抑制脱敏”的短语,即当反馈抑制得到消除或弱化时,也可以称为“对反馈抑制耐受”。通过例如搜索各种生物体可以获得显示增强的比活性的蛋白质。此外,通过向现有蛋白质中引入突变也可以获得高活性类型的固有蛋白质。待引入的突变可以是例如在蛋白质的一个或几个位置上一个或几个氨基酸残基的取代,缺失,插入和/或添加。可以通过例如如上所述的此类位点特异性突变方法来引入突变。突变也可以通过例如诱变处理来引入。诱变处理的实例可以包括X射线照射,紫外线照射和用突变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)处理。此外,可以通过用羟胺在体外直接处理DNA来诱导随机突变。比活性的增强可以独立使用,或者可以与如上述用于增强基因表达的此类方法任意组合使用。用于转化的方法不受特别限制,并且可以使用常规已知的方法。可以使用例如用氯化钙处理接受细胞以增加其对DNA的通透性的方法,其已经对大肠杆菌K-12菌株报道(Mandel,M.andHiga,A.,J.Mol.Biol.,1970,53,159-162),以及从生长阶段中的细胞制备感受态细胞,接着用DNA转化的方法,其已经对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)报告(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.E.,Gene,1977,1:153-167)。或者,可以使用使DNA-接受细胞变为原生质体或原生质球(其可以容易摄取重组DNA),接着将重组DNA引入DNA-接受细胞中的方法,已知该方法适用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(Chang,S.andChoen,S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.,168:111-115;Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,1978,Nature,274:398-400;Hinnen,A.,Hicks,J.B.andFink,G.R.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933)。此外,也可以使用对棒状杆菌细菌报告的电脉冲方法(日本专利公开(Kokai)No.2-207791)。可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质活性的增加。通过确认编码蛋白质的基因的表达增加,也可以确认蛋白质活性的增加。可以通过确认基因转录量的增加或通过确认从该基因表达的蛋白质量的增加来确认基因表达的增加。可以通过比较从基因转录的mRNA的量与非修饰菌株如野生型菌株或亲本菌株的mRNA量来确认基因转录量的增加。用于评估mRNA量的方法的实例可以包括Northern杂交,RT-PCR等(Sambrook,J.,etal.,MolecularCloningALaboratoryManual/第三版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加到例如非修饰菌株的mRNA量的1.2倍以上,1.5倍以上,2倍以上或3倍以上。可以通过使用抗体的Western印迹法(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)来确认蛋白质量的增加。蛋白质的量(诸如每细胞的蛋白质分子的数目)可以增加到例如非修饰菌株的蛋白质量的1.2倍以上,1.5倍以上,2倍以上或3倍以上。上述提高蛋白质活性的方法可用于提高任意蛋白质如目标物质生物合成酶,磷酸泛酰巯基乙胺基化酶和物质摄取系统的活性,和增强任意基因如编码那些任意蛋白质的基因的表达。<1-4>降低蛋白质活性的方法以下,将解释用于降低蛋白质诸如烯醇化酶的活性的方法。表述“蛋白质的活性得以降低”指与非修饰菌株相比蛋白质的活性得以降低。具体而言,表述“蛋白质的活性得以降低”可以意味着与非修饰菌株相比,每个细胞的蛋白质的活性得以降低。术语“非修饰菌株”可以指尚未以使目的蛋白质的活性得以降低的方式进行修饰的对照菌株。非修饰菌株的实例可以包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例可以包括微生物物种的相应类型菌株。非修饰菌株的具体实例还可以包括以上关于微生物描述所例示的菌株。也就是说,在一个实施方案中,与类型菌株,即微生物所属的物种的类型菌株相比,可以降低蛋白质的活性。在另一个实施方案中,与谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株相比,蛋白质的活性也可以得以降低。在另一个实施方案中,与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比,蛋白质的活性也可以得以降低。另一个实施方案中,与大肠杆菌K-12MG1655菌株相比,蛋白质的活性也可以得以降低。“蛋白质活性得以降低”的短语还可以包括当蛋白质的活性已经完全消失时。更具体地说,表述“蛋白质的活性得以降低”可以意味着与非修饰的菌株相比每个细胞的蛋白质的分子数目得以减少,和/或蛋白质的每个分子的功能得以降低。也就是说,表述“蛋白质的活性得以降低”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性,而且还可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。“每个细胞的蛋白质的分子数目得以减少”的短语还可以包括当完全不存在蛋白质时。“蛋白质的每个分子的功能得以降低”的短语也可以包括当每个蛋白质分子的功能完全消失时。蛋白质活性降低的程度没有特别限制,只要活性与非修饰菌株的活性相比降低即可。蛋白质的活性可以降低到例如非修饰菌株的蛋白质活性的50%或更少,20%或更少,10%或更少,5%或更少,或0%。可以通过例如减少编码蛋白质的基因的表达来实现用于降低蛋白质活性的修饰。短语“基因的表达得以降低”指与非修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比,该基因的表达得以降低。具体而言,短语“基因表达得以降低”可以意味着与非修饰菌株相比,每个细胞的基因表达得以降低。更具体地说,短语“基因表达得以降低”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)得以减少,和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质量)得以减少。“基因表达得以降低”的短语也可以包括当基因完全不表达时。“基因表达得以降低”的短语也可以称为“基因表达得以弱化”。基因的表达可以降低到例如非修饰菌株的表达的50%或更少,20%或更少,10%或更少,5%或更少,或0%。基因表达的降低可以是由于例如转录效率降低,翻译效率降低或组合所致。可以通过修饰基因的表达控制序列诸如启动子,Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以称为核糖体结合位点(RBS)),和基因的RBS和起始密码子之间的间隔物区来降低基因的表达。当修饰表达控制序列时,修饰表达控制序列的一个或多个核苷酸,两个或更多个核苷酸,或三个或更多个核苷酸。例如,通过用更弱的启动子替换染色体上基因的启动子,可以降低基因的转录效率。术语“更弱的启动子”可以指与基因固有的野生型启动子相比,提供基因的弱化转录的启动子。更弱启动子的实例可以包括例如诱导型启动子。也就是说,诱导型启动子可以在非诱导条件下,例如在不存在相应诱导物的情况下,起到更弱启动子的作用。更弱启动子的实例还可以包括例如P4和P8启动子(分别为SEQIDNO:109的位置872-969和SEQIDNO:110的位置901-1046)。此外,可以缺失表达控制序列的一部分或全部。基因的表达还可以通过例如操纵负责表达控制的因子来降低。负责表达控制的因子的实例可以包括负责转录或翻译控制的低分子(诸如诱导剂,抑制剂等),负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等),负责转录或翻译控制的核酸(诸如siRNA等),等等。此外,通过例如对基因的编码区引入降低基因表达的突变,也可以降低基因的表达。例如,通过用在宿主中不太频繁使用的同义密码子替换基因编码区中的密码子,可以降低基因的表达。此外,例如,如本文所述,基因表达可以由于基因的破坏而降低。用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如破坏编码该蛋白质的基因来获得。短语“基因受到破坏”可以指基因以使得不产生通常可以起作用的蛋白质的方式进行了修饰。“不产生通常可以起作用的蛋白质”的短语可以包括当完全不从基因产生蛋白质时和当从基因产生每个分子的功能(例如活性或性质)得以降低或消除的蛋白质时。可以通过例如缺失染色体上的基因来获得基因的破坏。术语“基因的缺失”可以指基因编码区的部分或整个区域的缺失。此外,可以缺失包括染色体上基因的编码区上游和下游序列的整个基因。只要可以降低蛋白质的活性,待缺失的区域可以是任何区域,例如N端区域(即编码蛋白质的N端区域的区域),内部区域或C端区域(即编码蛋白质的C端区域的区域)。缺失更长的区域通常可以更确定地使基因失活。待缺失的区域可以是具有例如基因的编码区的总长度的10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上的长度的区域。此外,优选的是,待缺失的区域的上游和下游序列的阅读框不相同。读码框的不一致性可以引起待缺失的区域下游的移码。例如,也可以通过对染色体上基因的编码区引入用于氨基酸取代的突变(错义突变),终止密码子的突变(无义突变),添加或缺失一个或两个核苷酸残基的突变(移码突变)等获得基因的破坏(JournalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997);ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,955511-5515(1998);JournalofBiologicalChemistry,26116,20833-20839(1991))。也可以通过例如将另一个核苷酸序列插入到染色体上的基因的编码区中获得基因的破坏。插入的位点可以位于基因的任何区域中,并且插入更长的核苷酸序列通常可以更确定地使基因失活。优选的是插入位点上游和下游序列的阅读框不相同。读码框的不一致性可以引起待缺失的区域下游的移码。其他核苷酸序列没有特别限制,只要选择降低或消除所编码蛋白质活性的序列即可,并且其实例可以包括例如标志物基因如抗生素抗性基因,以及可用于产生目标物质的基因。特别地,可以以编码蛋白质的氨基酸序列得以缺失的方式进行基因的破坏。换言之,可以通过例如缺失蛋白质的氨基酸序列,特别地修饰基因以使该基因编码氨基酸序列得以的蛋白质来实现降低蛋白质活性的修饰。短语“蛋白质的氨基酸序列的缺失”可以指蛋白质的氨基酸序列的部分或整个区域的缺失。另外,短语“蛋白质的氨基酸序列的缺失”可以指原始氨基酸序列在蛋白质中消失,并且还可以包括当原始氨基酸序列变为另一个氨基酸序列时。也就是说,例如,通过移码改变为另一氨基酸序列的区域可以视为缺失区域。当蛋白质的氨基酸序列得以缺失时,通常缩短蛋白质的总长度,但也可以存在蛋白质的总长度没有改变或延长的情况。例如,通过缺失基因编码区的部分或整个区域,可以在编码的蛋白质中缺失由缺失区域编码的区域。另外,例如,通过将终止密码子引入基因的编码区中,可以在编码的蛋白质中缺失由引入位点的下游区域编码的区域。另外,例如,通过在基因的编码区中移码,可以在编码的蛋白质中缺失由移码区编码的区域。关于基因缺失中待缺失区域的位置和长度的上述描述可以在必要修改后应用于缺失蛋白质氨基酸序列中待缺失区域的位置和长度。如上所述的染色体上基因的此类修饰可以如下获得:通过例如制备以使基因不能产生通常起作用的蛋白质的方式进行了修饰的破坏类型基因,并用含有破坏类型基因的重组DNA转化宿主以引起破坏类型基因和染色体上的野生型基因之间的同源重组,从而用该破坏类型基因取代染色体上的野生型基因。在该程序中,若重组DNA中包括根据宿主特征如营养缺陷选择的标志物基因,则操作变得更容易。破坏类型基因的实例可以包括编码区的部分或整个区域得以缺失的基因,包含错义突变的基因,包括无义突变的基因,包含移码突变的基因,以及包含转座子或标志物基因插入的基因。由破坏类型基因编码的蛋白质即使产生也具有与野生型蛋白质不同的构象,因此其功能得以降低或消除。已经建立了基于使用同源重组的基因取代的此类基因破坏,并且存在使用线性DNA的方法,诸如称为“Red驱动整合”的方法(Datsenko,K.A,andWanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000)),以及利用Red驱动的整合与源自λ噬菌体的切除系统的组合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))(参考WO2005/010175),使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法,使用能够接合转移的质粒的方法,利用没有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法(美国专利号6,303,383,日本专利公开(Kokai)No.05-007491),等等。用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如诱变处理来获得。诱变处理的实例包括X射线或紫外线的照射和用突变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)处理。如上文提及的用于降低蛋白质活性的此类方法可以独立使用或者以任意组合使用。当蛋白质作为由多个亚基构成的复合物起作用时,可以修饰多个亚基的部分或全部,只要蛋白质的活性最终得以降低。也就是说,例如,编码相应亚基的多个基因的部分或全部可以得以破坏等。此外,当蛋白质存在多种同工酶时,多种同工酶的部分或全部活性可以得以降低,只要蛋白质的活性最终得以降低。也就是说,例如,编码相应同功酶的多个基因的部分或全部可以得以破坏等。可以通过测量蛋白质的活性确认蛋白质活性的降低。蛋白质活性的降低也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达的降低来确认。基因表达的降低可以通过确认基因转录量的减少或从基因表达的蛋白质量的降低来确认。通过比较从基因转录的mRNA的量与非修饰菌株中观察到的量,可以确认基因转录量的降低。用于评估mRNA量的方法的实例可以包括Northern杂交,RT-PCR等(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。mRNA的量可以降低到例如在非修饰菌株中观察到的量的50%或更少,20%或更少,10%或更少,5%或更少,或0%。通过使用抗体的Western印迹法(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)2001)可以确认蛋白质量的减少。蛋白质的量(诸如每个细胞的蛋白质的分子数目)可以降低到例如在非修饰菌株中观察到的蛋白质量的50%或更少,20%或更少,10%或更少,5%或更少,或0%。可以根据用于破坏的手段通过确定基因的部分或全部的核苷酸序列,基因的限制酶图谱,全长等来确认基因的破坏。除烯醇化酶活性的弱化外,上述的降低蛋白质活性的方法还可以适用于任意蛋白质诸如副产物生成酶的活性降低,以及任意基因诸如编码那些任意蛋白的基因的表达降低。<2>用于生产目标物质的方法如本文中描述的方法是通过使用如本文中描述的微生物生产目标物质的方法。<2-1>发酵方法可以通过例如如本文中描述的微生物的发酵来生产目标物质。也就是说,如本文中描述的方法的实施方案可以是通过发酵微生物来生产目标物质的方法。此实施方案也可以称为“发酵方法”。此外,通过发酵如本文中所述的微生物生产目标物质的步骤也可以称为“发酵步骤”。可以通过培养如本文中描述的微生物来进行发酵步骤。具体而言,在发酵方法中,可以从碳源生产目标物质。也就是说,发酵步骤可以是例如在培养基,诸如含有碳源的培养基中培养微生物以在培养基中生产和积累目标物质的步骤。也就是说,发酵方法可以是用于生产目标物质的方法,其包括以下步骤:例如在培养基,诸如含有碳源的培养基中培养微生物以在培养基中生产和积累目标物质的方法。此外,换言之,发酵步骤可以是例如通过使用微生物从碳源生产目标物质的步骤。待使用的培养基没有特别限制,只要微生物可以在其中增殖并产生目标物质即可。作为培养基,例如可以使用用于培养微生物诸如细菌和酵母的典型培养基。培养基可以根据需要含有碳源,氮源,磷酸盐源,硫源,以及其他培养基组分,如各种有机组分和无机组分。培养基成分的类型和浓度可以根据诸如选择的微生物的类型等各种条件适当确定。碳源没有特别限制,只要微生物可以利用它并产生目标物质即可。碳源的具体实例可以包括例如糖类,诸如葡萄糖,果糖,蔗糖,乳糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖,赤糖糊(blackstrapmolasses),淀粉的水解物和生物质的水解物;有机酸如乙酸,柠檬酸,琥珀酸和葡糖酸;醇如乙醇,甘油和粗甘油;和脂肪酸。作为碳源,特别地,可以使用植物来源的材料。植物的实例可以包括例如玉米,稻,小麦,大豆,甘蔗,甜菜和棉。植物来源材料的实例可以包括例如器官,诸如根,茎,干,枝,叶,花和种子,包括它们的植物体和这些植物器官的分解产物。植物来源材料的在其使用时的形式没有特别限定,并且它们可以以诸如未加工产物,汁,研磨产物,纯化产物等任何形式使用。戊糖如木糖,己糖如葡萄糖或它们的混合物可从例如植物生物质获得并且得到使用。具体而言,可以通过将植物生物质进行处理,诸如蒸汽处理,浓酸水解,稀酸水解,纤维素酶等酶水解,碱处理而得到这些糖类。由于半纤维素与纤维素相比通常更容易水解,因此可预先水解植物生物质中的半纤维素以释放戊糖,然后可以水解纤维素以产生己糖。此外,木糖可以通过例如通过对微生物赋予用于将己糖如葡萄糖转化为木糖的途径从己糖转化供应。作为碳源,可以使用一种碳源,或者可以组合使用两种或更多种碳源。培养基中碳源的浓度没有特别限制,只要微生物可以增殖并产生目标物质即可。培养基中碳源的浓度可以在使得目标物质的生产不受抑制的范围内尽可能高。碳源在培养基中的初始浓度通常可以是例如通常5至30%(w/v),或10至20%(w/v)。此外,可以根据需要对培养基添加碳源。例如,可以与伴随发酵进展的碳源的减少或消减成比例地对培养基添加碳源。虽然可以暂时消减碳源,但是只要最终可以生产目标物质,可以优选以不消减碳源或不继续消减碳源的方式进行培养。氮源的具体实例可以包括例如铵盐如硫酸铵,氯化铵和磷酸铵,有机氮源如蛋白胨,酵母提取物,肉膏和大豆蛋白分解产物,氨和尿素。用于pH调节的氨气和氨水也可用作氮源。作为氮源,可以使用一种氮源,也可以组合使用两种或更多种的氮源。磷酸盐源的具体实例可以包括例如磷酸盐如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾,以及磷酸聚合物如焦磷酸。作为磷酸盐源,可以使用一种磷酸盐源,或者可以组合使用两种或更多种磷酸盐源。硫源的具体实例可以包括例如无机硫化合物如硫酸盐,硫代硫酸盐和亚硫酸盐,以及含硫氨基酸如半胱氨酸,胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源,可以使用一种硫源,或者可以组合使用两种或更多种硫源。其他各种有机和无机组分的具体实例可以包括例如无机盐如氯化钠和氯化钾;微量金属如铁,锰,镁和钙;维生素如维生素B1,维生素B2,维生素B6,烟酸,烟酰胺和维生素B12;氨基酸;核酸;和含有这些的有机成分如蛋白胨,酪蛋白氨基酸,酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其他各种有机和无机组分,可以使用一种组分,或者可以组合使用两种或更多种组分。此外,当使用需要营养物如氨基酸进行生长的营养缺陷型突变株时,优选培养基含有此类需要的营养物。此外,培养基可以含有用于生产目标物质的组分。此类组分的具体实例可以包括例如甲基供体例如SAM及其前体例如甲硫氨酸。培养条件没有特别限制,只要微生物可以增殖并且产生目标物质即可。培养可以用例如用于培养微生物诸如细菌和酵母的典型条件进行。培养条件可以根据诸如选择的微生物的种类等各种条件适当确定。培养可以通过使用液体培养基来进行。在培养时,例如,可以将在诸如琼脂培养基等固体培养基上培养的微生物直接接种到液体培养基中,或者将在液体培养基中作为种子培养物培养的微生物接种到液体培养基中进行主要培养。也就是说,培养可以作为种子培养和主要培养分开进行。在此类情况下,种子培养和主要培养的培养条件可以是相同的或者可以是不相同。至少在主要培养过程中产生目标物质是足够的。培养开始时培养基中存在的微生物的量没有特别限制。例如,显示OD660为4-100的种子培养液可以在开始培养时以0.1-100质量%,或1-50质量%的量接种到用于主要培养的培养基中。培养可以以分批培养,补料分批培养,连续培养或这些的组合进行。在培养开始时使用的培养基也可以称为“起始培养基”。在补料分批培养或连续培养中添加到培养系统(例如发酵罐)的培养基也可以称为“补料培养基”。为了在补料分批培养或者连续培养中向培养系统添加补料培养基也可以称为“补料”。此外,当作为种子培养和主要培养分开进行培养时,种子培养和主要培养的培养方案可以相同或可以不同。例如,种子培养和主要培养两者都可以作为分批培养进行。或者,例如,种子培养可以作为分批培养进行,并且主要培养可以以补料分批培养或连续培养进行。各种组分诸如碳源可以存在于起始培养基,补料培养基或两者中。也就是说,各种组分诸如碳源可以在培养期间独立地或以任意组合的方式添加到培养基。这些组分可以添加一次或多次,或者可以连续添加。起始培养基中存在的组分的类型可以与补料培养基中存在的组分的类型相同或不同。此外,起始培养基中存在的组分的浓度可以与补料培养基中存在的组分的浓度相同或不同。此外,可以使用两种或更多种含有不同类型和/或不同浓度组分的补料培养基。例如,当间歇进行两次或更多次补料时,补料培养基中存在的组分的类型和/或浓度对于每次补料可以是相同的或者可以是不同的。培养可以例如在需氧条件下进行。术语“需氧条件”可以指其中培养基中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高,或1.5ppm或更高的条件。可以将氧浓度控制为例如饱和氧浓度的1-50%,或约5%。培养可以例如在通气或摇动下进行。培养基的pH值可以是例如3至10,或4.0至9.5。培养基的pH可以根据需要在培养过程中进行调整。培养基的pH可以通过使用各种碱性和酸性物质如氨气,氨水,碳酸钠,碳酸氢钠,碳酸钾,碳酸氢钾,碳酸镁,氢氧化钠,氢氧化钙和氢氧化镁来调节。培养温度可以是例如20至45℃,或25至37℃。培养时间可以是例如10至120小时。例如,可以继续培养直到培养基中存在的碳源被消耗,或者直到微生物的活性丧失。通过在诸如上文所述的条件下培养微生物,在培养基中积累目标物质。可以通过用于检测或鉴定化合物的已知方法来确认目标物质的产生。此类方法的实例可以包括例如HPLC,UPLC,LC/MS,GC/MS和NMR。这些方法可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。这些方法也可以用于确定培养基中存在的各种组分的浓度。生产的目标物质可以适当收集。也就是说,发酵方法可以进一步包括收集目标物质的步骤。此步骤也可以称为“收集步骤”。收集步骤可以是从培养肉汤,特别是从培养基中收集目标物质的步骤。目标物质可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法收集。此类方法的实例可以包括例如离子交换树脂法,膜处理,沉淀,提取,蒸馏和结晶。具体地,目标物质也可以通过用有机溶剂如乙酸乙酯萃取或通过蒸汽蒸馏来收集。这些方法可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。此外,当目标物质沉淀在培养基中时,它可以通过例如离心或过滤收集。在培养基中溶解的目标物质结晶后,可以将沉淀在培养基中的目标物质和溶解在培养基中的目标物质一起分离。除了目标物质之外,收集的目标物质可以包含例如微生物细胞,培养基组分,水分和微生物的副产物代谢物。收集的目标物质的纯度可以是例如30%(w/w)或更高,50%(w/w)或更高,70%(w/w)或更高,80%(w/w)或更高,90%(w/w)或更高,或95%(w/w)或更高。<2-2>生物转化方法目标物质也可以通过例如使用如本文中所述的微生物的生物转化来产生。也就是说,如本文中所述的方法的另一个实施方案可以是使用微生物通过生物转化来生产目标物质的方法。该实施方案也可以称为“生物转化方法”。此外,使用微生物通过生物转化来生产目标物质的步骤也可以称为“生物转化步骤”。具体而言,在生物转化方法中,目标物质可以从目标物质的前体产生。更具体而言,在生物转化方法中,通过使用微生物,可以通过将目标物质的前体转化为目标物质来生产目标物质。也就是说,生物转化步骤可以是通过使用微生物将目标物质的前体转化为目标物质的步骤。目标物质的前体也可以简称为“前体”。前体的实例可以包括下述物质,该物质向目标物质的转化包括需要SAM。前体的具体实例可以包括目标物质的生物合成途径的中间体,如就目标物质生物合成酶的描述而言所述的那些,条件是中间体向目标物质的转化需要SAM。前体的更具体实例可以包括例如原儿茶酸,原儿茶醛,L-色氨酸,L-组氨酸,香草酸,苯甲酸,L-苯丙氨酸,L-酪氨酸,L-精氨酸,L-鸟氨酸和甘氨酸。原儿茶酸可以用作生产例如香草醛,香草酸或愈创木酚的前体。原儿茶醛可以用作生产例如香草醛的前体。L-色氨酸可以用作生产例如褪黑激素的前体。L-组氨酸可以用作生产例如麦角硫因的前体。L-苯丙氨酸和L-酪氨酸各自可以用作生产例如阿魏酸,4-乙烯基愈创木酚或4-乙基愈创木酚的前体。L-精氨酸和L-鸟氨酸各自可以用作生产例如多胺的前体。L-精氨酸和甘氨酸各自可以用作生产例如肌酸的前体。作为前体,可以使用一种前体,或者可以组合使用两种或更多种前体。在前体是可以形成盐的化合物的情况下,前体可以作为游离化合物,其盐或其混合物使用。也就是说,术语“前体”可以指游离形式的前体,其盐或其混合物,除非另有说明。盐的实例可以包括例如硫酸盐,盐酸盐,碳酸盐,铵盐,钠盐和钾盐。作为前体的盐,可以使用一种盐,或者可以组合使用两种或更多种盐。作为前体,可以使用商业产品,或者可以使用适当制备和获得的产品。也就是说,生物转化方法可以进一步包括生产前体的步骤。生产前体的方法没有特别限定,例如可以使用已知的方法。前体可以通过例如化学合成法,酶法,生物转化法,发酵法,提取方法或它们的组合来生产。也就是说,例如,目标物质的前体可以使用酶(该酶也可以称为“前体生物合成酶”)从其另外的前体产生,所述酶催化此类另外的前体转化成目标物质的前体。此外,例如,通过使用具有前体生产能力的微生物,可以从碳源或此类另外的前体生产目标物质的前体。短语“具有前体生产能力的微生物”可以指能够从碳源或其另外的前体生产目标物质的前体的微生物。例如,根据酶法或生物转化法生产原儿茶酸的方法的实例可以包括使用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KS-0180(日本专利公开(Kokai)No.7-75589)将对甲酚转化为原儿茶酸的方法,使用NADH依赖性对羟基苯甲酸羟化酶将对羟基苯甲酸转化为原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.5-244941),通过在含有对苯二甲酸的培养基中培养含有参与从对苯二甲酸生成原儿茶酸的反应的基因的转化体来生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.2007-104942),以及通过使用具有原儿茶酸生产能力并且具有原儿茶酸5-氧化酶活性降低或该活性缺乏的微生物从其前体生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.2010-207094)。此外,通过发酵生产原儿茶酸的方法的实例可以包括通过使用短杆菌属细菌和乙酸作为碳源生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.50-89592),通过使用引入有编码3-二氢莽草酸脱氢酶的基因的埃希氏菌属或克雷伯氏菌属细菌和葡萄糖作为碳源生产原儿茶酸的方法(美国专利号5,272,073)。此外,原儿茶醛可以通过根据使用ACAR的酶法或使用具有ACAR的微生物的生物转化法使用原儿茶酸作为前体生产。生产的前体可以原样或者根据需要进行适当的处理如浓缩,稀释,干燥,溶解,分馏,提取和纯化后用于生物转化方法。也就是说,作为前体,例如可以使用纯化至所需程度的纯化产物,或者可以使用含有前体的材料。含有前体的材料没有特别限制,只要微生物可以使用前体即可。含有前体的材料的具体实例可以包括通过培养具有前体生产能力的微生物获得的培养肉汤,与培养肉汤分离的培养上清液及其加工产物如其浓缩产物(如浓缩液体)和其干燥产物。在一个实施方案中,生物转化步骤可以通过例如培养如本文中所述的微生物来进行。该实施方案也可以称为“生物转化方法的第一实施方案”。也就是说,生物转化步骤可以是例如在含有目标物质的前体的培养基中培养微生物以将该前体转化为目标物质的步骤。生物转化步骤具体可以是在含有目标物质的前体的培养基中培养微生物以在培养基中产生并积累目标物质的步骤。要使用的培养基没有特别限制,只要培养基含有目标物质的前体,并且微生物可以在其中增殖并产生目标物质。培养条件没有特别限制,只要微生物可以增殖并且产生目标物质即可。关于发酵方法所提及的培养的描述,诸如关于培养基和培养条件的描述可以在必要修改后适用于生物转化方法的第一实施方案中的培养,只是培养基在第一实施方案中含有前体。前体可以在整个培养期内存在在培养基中,或者可以在培养的部分时期期间存在在培养基中。也就是说,短语“在含有前体的培养基中培养微生物”并不一定意味着培养基中在整个培养期内都存在前体。例如,从培养开始起培养基中可以存在或可以不存在前体。当在培养开始时培养基中不存在前体时,在培养开始后将前体添加到培养基。添加的时机可以根据诸如培养期的长度等各种条件适当确定。例如,在微生物充分生长后,可以将前体添加到培养基中。此外,在任何情况下,可以根据需要将前体添加到培养基。例如,可以与伴随目标物质生成的前体的减少或消减成比例地对培养基添加前体。用于将前体添加到培养基的方法没有特别限制。例如,可以通过将含有前体的补料培养基补料到培养基来将前体供应给培养基。此外,例如,如本文中所述的微生物和具有前体生产能力的微生物可以共培养以允许具有前体生产能力的微生物在培养基中产生前体,从而将前体添加到培养基。这些添加方法可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。前体在培养基中的浓度没有特别限制,只要微生物可以使用该前体作为目标物质的原料即可。前体在培养基中的浓度例如可以为0.1g/L或更高,1g/L或更高,2g/L或更高,5g/L或更高,10g/L或更高,或者15g/L或更高,或者可以是200g/L或更低,100g/L或更低,50g/L或更低,或者20g/L或更低,或者可以在由其组合限定的范围内(按游离化合物的重量计)。在整个培养期内,前体可以以或不以上文例示的范围内的浓度存在于培养基中。例如,在培养开始时前体可以以上文例示的范围内的浓度存在于培养基中,或者可以将其添加到培养基,从而在培养开始后获得上文例示的范围。在培养分别作为种子培养和主要培养进行的情况下,至少在主要培养期间产生目标物质是足够的。因此,足够的是至少在主要培养期间,即在主要培养的整个时期内或在主要培养的部分时期期间,培养基中存在前体,并且也就是说,在种子培养期间培养基中可以存在或可以不存在前体。在此类情况下,关于培养的术语,如“培养期(培养时期)”和“培养开始”可以理解为与主要培养有关的术语。在另一个实施方案中,生物转化步骤也可以通过例如使用如本文中所述的微生物的细胞来进行。该实施方案也可以称为“生物转化方法的第二实施方案”。也就是说,生物转化步骤可以是例如通过使用微生物的细胞将反应混合物中的目标物质的前体转化成目标物质的步骤。生物转化步骤具体可以是使微生物的细胞作用于反应混合物中的目标物质的前体以在反应混合物中生成并积累目标物质的步骤。通过使用此类细胞进行的生物转化步骤也可以称为“转化反应”。微生物的细胞可以通过培养微生物来获得。用于获得细胞的培养方法没有特别限制,只要微生物可以增殖即可。在用于获得细胞的培养时,前体可以存在或可以不存在于培养基中。此外,在用于获得细胞的培养时,培养基中可以产生或可以不产生目标物质。关于发酵方法中所述的培养的描述,例如关于培养基和培养条件的描述可以在必要修改后应用于获得用于生物转化方法的第二实施方案的细胞的培养。细胞可以在存在于培养肉汤(具体是培养基)中时,或者在从培养肉汤(具体是培养基)中收集后用于转化反应。也可以根据需要在进行处理后将细胞用于转化反应。也就是说,细胞的实例可以包括含有细胞的培养肉汤,从培养肉汤中收集的细胞和其加工产物。换言之,细胞的实例可以包括存在于微生物的培养肉汤中的细胞,从培养肉汤中收集的细胞或存在于其加工产物中的细胞。加工产物的实例可以包括通过对细胞进行处理,特别地通过对含有细胞的培养肉汤或从培养肉汤中收集的细胞进行处理而获得的产物。这些形式的细胞可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。从培养基中收集细胞的方法没有特别限制,例如可以使用已知的方法。此类方法的实例可以包括例如自发沉淀,离心和过滤。也可以使用絮凝剂。这些方法可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。收集的细胞可以根据需要通过使用合适的培养基进行清洗。收集的细胞可以根据需要通过使用适当的培养基重悬浮。可用于清洗或悬浮细胞的培养基的实例可以包括例如水性介质(水性溶剂),如水和缓冲水溶液。细胞处理的实例可以包括例如稀释,冷凝,在载体如丙烯酰胺和角叉菜胶上固定化,冷冻和融化处理,以及增加细胞膜通透性的处理。例如,可以通过使用表面活性剂或有机溶剂来增加细胞膜的通透性。这些处理可以独立使用,或者可以以适当的组合使用。用于转化反应的细胞没有特别限制,只要细胞具有目标物质生产能力。优选细胞保持其代谢活性。短语“细胞保持其代谢活性”可以表示细胞具有利用碳源产生或再生产生目标物质所需物质的能力。此类物质的实例可以包括例如ATP,电子供体如NADH和NADPH,以及甲基供体如SAM。细胞可以具有或可以不具有增殖能力。转化反应可以在适当的反应混合物中进行。具体而言,转化反应可以通过使细胞和前体共存于适当的反应混合物中来进行。转化反应可以通过分批方法进行或可以通过柱方法进行。在分批法的情况下,转化反应可以通过例如将微生物的细胞和前体混合在反应容器中所含的反应混合物中来进行。转化反应可以静态进行,或者可以在搅拌或摇动反应混合物的情况下进行。在柱方法的情况下,转化反应可以通过例如使含有前体的反应混合物通过填充有固定化细胞的柱来进行。反应混合物的实例可以包括基于水性介质(水性溶剂)如水和水性缓冲液的那些。除了前体之外,反应混合物可以根据需要含有除前体之外的组分。除前体以外的成分的实例可以包括ATP,电子供体诸如NADH,NADPH,甲基供体诸如SAM,金属离子,缓冲剂,表面活性剂,有机溶剂,碳源,磷酸盐源,和其它各种培养基成分。也就是说,例如,含有前体的培养基也可以用作反应混合物。也就是说,关于生物转化方法的第一实施方案中提及的培养基的描述也可以在必要修改后适用于生物转化方法的第二实施方案中的反应混合物。存在于反应混合物中的组分的类型和浓度可以根据各种条件来确定,例如待使用的前体的类型和待使用的细胞的形式。转化反应的条件,诸如溶解氧浓度,反应混合物的pH,反应温度,反应时间,各种成分的浓度等没有特别限制,只要产生目标物质。转化反应可以用例如用于利用微生物细胞诸如静止细胞进行物质转化的典型条件来进行。转化反应的条件可以根据各种条件来确定,例如选择的微生物的类型。转化反应可以例如在需氧条件下进行。术语“需氧条件”可以指其中反应混合物中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高,或1.5ppm或更高的条件。氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的1-50%,或约5%。反应混合物的pH值通常可以是例如6.0至10.0,或6.5至9.0。反应温度可以是例如15至50℃,或15至45℃,或20至40℃。反应时间可以是例如5分钟至200小时。在柱方法的情况下,反应混合物的加载速率可以是例如使得反应时间落入上述例示的反应时间范围内的速率。此外,转化反应也可以在例如培养条件下进行,例如用于培养微生物诸如细菌和真菌的典型条件。在转化反应期间,细胞可以增殖或可以不增殖。也就是说,关于生物转化方法的第一实施方案的培养条件的描述也可以在必要修改后适用于生物转化方法的第二实施方案中转化反应的条件,只是细胞可以或不可以在第二实施方案中增殖。在此类情况下,用于获得细胞的培养条件和转化反应的条件可以相同或不同。前体在反应混合物中的浓度例如可以为0.1g/L或更高,1g/L或更高,2g/L或更高,5g/L或更高,10g/L或更高,或者15g/L或更高,或者可以是200g/L或更低,100g/L或更低,50g/L或更低,或者20g/L或更低,或者可以在由其组合限定的范围内(按游离化合物的重量计)。例如,反应混合物中细胞的密度可以是1或更高,或者可以是300或更低,或者可以在其组合限定的范围内(按600nm的光密度(OD)计)。在转化反应期间,可以将细胞,前体和其他组分独立地或以其任何任意组合添加到反应混合物。例如,可以与伴随目标物质产生的前体的减少或消耗成比例将前体添加到反应混合物。这些组分可以添加一次或多次,或者可以连续添加。用于向反应混合物添加诸如前体的各种组分的方法没有特别限制。这些组分各自可以通过例如直接将它们加入到反应混合物中而添加到反应混合物中。此外,例如,可以将如本文中所述的微生物和具有前体生产能力的微生物共培养,以使具有前体生产能力的微生物在反应混合物中产生前体,从而将前体提供给反应混合物。此外,例如,组分如ATP,电子给体和甲基供体可以各自在反应混合物中产生或再生,可以在微生物的细胞中产生或再生,或者可以通过不同细胞之间的偶联反应产生或再生。例如,当微生物的细胞保持其代谢活性时,它们可以通过使用碳源在它们内部产生或再生诸如ATP,电子供体和甲基供体等组分。例如,具体地,微生物可以具有增强的SAM生成或再生能力,并且其生成或再生的SAM可以用于转化反应。SAM的生成或再生可以与用于生成或再生SAM的任何其他方法组合而得到进一步增强。另外,ATP生成或再生方法的实例可以包括例如通过使用棒状杆菌属细菌从碳源提供ATP的方法(Hori,H.etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(6):693-698(1997)),通过使用酵母细胞和葡萄糖再生ATP的方法(Yamamoto,Setal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,69(4):784-789(2005)),使用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶再生ATP的方法(C.Aug'eandCh.Gautheron,TetrahedronLett.,29:789-790(1988)),以及通过使用多磷酸和多磷酸激酶再生ATP的方法(Murata,K.etal.,Agric.Biol.Chem.,52(6):1471-1477(1988))。此外,反应条件可以从转化反应的开始至结束是恒定的,或者它们可以在转化反应期间改变。表述“反应条件在转化反应期间改变”不仅可以包括当反应条件在时间上改变时,而且还包括当反应条件在空间上改变时。表述“反应条件在空间上改变”表示例如当通过柱法进行转化反应时,反应温度和孔密度等反应条件随流动中的位置而不同。通过进行如上所述的生物转化步骤,获得培养肉汤(具体地培养基)或含有目标物质的反应混合物。目标物质的产生和目标物质的收集的确认可以以与上述发酵方法相同的方式进行。也就是说,生物转化方法可以进一步包括收集步骤,例如从培养肉汤(具体地培养基)或反应混合物中收集目标物质的步骤。除了目标物质之外,收集的目标物质可以包含例如微生物细胞,培养基组分,反应混合物组分,水分和微生物的副产物代谢物。收集的目标物质的纯度可以是,例如,30%(w/w)或更高,50%(w/w)或更高,70%(w/w)或更高,80%(w/w)或更高,90%(w/w)或更高,或95%(w/w)或更高。<2-3>生产香草醛和其他目标物质的方法当通过使用如本文所述的微生物,即通过发酵方法或生物转化方法生产目标物质时,由此产生的目标物质可以进一步转化为另一种目标物质。因此,本发明提供了制备第二目标物质,即目标物质B的方法,所述方法包括以下步骤:通过使用微生物,即通过发酵方法或生物转化方法产生第一目标物质,即目标物质A,并且将由此产生的第一目标物质A转化为第二目标物质B。例如,当通过使用如本文所述的微生物,即通过发酵方法或生物转化方法生产香草酸时,由此产生的香草酸可以进一步转化为香草醛。因此,本发明提供了生产香草醛的方法,其包括通过使用微生物,即通过发酵方法或生物转化方法生产香草酸,并将由此产生的香草酸转化为香草醛的步骤。该方法也可以称为“香草醛生产方法”。通过使用微生物产生的香草酸可以原样用于转化成香草醛,或者在根据需要进行适当的处理如浓缩,稀释,干燥,溶解,分馏,提取和纯化之后用于转化成香草醛。也就是说,作为香草酸,例如,可以使用纯化至期望程度的纯化产物,或者可以使用含有香草酸的物质。含有香草酸的物质没有特别限制,只要催化转化的组分(例如微生物和酶)可以使用香草酸。含有香草酸的材料的具体实例可以包括含有香草酸的培养肉汤或反应混合物,从培养肉汤或反应混合物中分离的上清液,及其加工产物,如浓缩产物,如其浓缩液及其干燥产物。将香草酸转化为香草醛的方法没有特别限制。可以通过例如使用具有ACAR的微生物的生物转化方法将香草酸转化为香草醛。具有ACAR的微生物可以以烯醇化酶活性得以降低的方式或者可以不以烯醇化酶活性得以降低的方式进行修饰。关于如本文所述的微生物的描述可以在必要的修改后适用于具有ACAR的微生物,只是具有ACAR的微生物可以以使烯醇化酶活性得以降低的方式进行修饰或可以不以使烯醇化酶活性得以降低的方式进行修饰。具有ACAR的微生物可以以ACAR、PPT和香草酸摄取系统中的一种或多种的活性得以增强的方式进行修饰。另外,关于使用微生物生产目标物质的生物转化方法的描述可以在必要的修改后适用于使用具有ACAR的微生物将香草酸转化为香草醛的生物转化方法。也可以例如通过使用ACAR的酶方法将香草酸转化成香草醛。ACAR可以通过允许具有ACAR基因的宿主表达ACAR基因来生成。ACAR也可以用无细胞蛋白质表达系统来生成。具有ACAR基因的宿主也可以称为“具有ACAR的宿主”。具有ACAR基因的宿主可以是固有地具有ACAR基因的宿主,或者可以是经修饰而具有ACAR基因的宿主。固有地具有ACAR基因的宿主的实例可以包括衍生出上述示例的ACAR的生物体。经修饰而具有ACAR基因的宿主的实例可以包括已经引入有ACAR基因的宿主。此外,固有地具有ACAR基因的宿主可以以ACAR得以增加的方式进行修饰。用于表达ACAR的宿主不受特别限制,只要宿主可以表达可以起作用的ACAR即可。宿主的实例可以包括例如,微生物,如细菌和酵母(真菌),植物细胞,昆虫细胞和动物细胞。可以通过培养具有ACAR基因的宿主来表达ACAR基因。培养方法没有特别限制,只要具有ACAR基因的宿主可以增殖并表达ACAR即可。关于发酵方法培养的描述可以在必要的修改后适用于具有ACAR基因的宿主的培养。必要时,可以诱导ACAR基因的表达。作为培养的结果,可以获得含有ACAR的培养肉汤。ACAR可以在宿主细胞和/或培养基中积累。在宿主细胞,培养基等中包含的ACAR可以原样用于酶促反应,或者自其纯化的ACAR可以用于酶促反应。可以进行纯化到期望的程度。也就是说,作为ACAR,可以使用纯化的ACAR,或者可以使用含有ACAR的级分。此类级分没有特别限制,只要其中含有的ACAR可以作用于香草酸即可。此类级分的实例可以包括具有ACAR基因的宿主的培养肉汤,即具有ACAR的宿主;从培养肉汤中收集细胞;细胞的加工产物,如细胞破碎物,细胞裂解物,细胞提取物和固定化细胞,如用丙烯酰胺,角叉菜胶等固定化的细胞;从培养肉汤中收集的培养物上清液;其部分纯化产物,例如粗产物;及其组合。这些级分可以独立使用或与纯化的ACAR组合使用。酶促反应可以通过允许ACAR作用于香草酸来进行。酶促反应的条件没有特别限制,只要产生香草醛即可。酶促反应可以用例如用于使用酶或微生物细胞如静息细胞进行物质转化的典型条件进行。例如,关于生物转化方法的第二实施方案中的转化反应的描述也可以在必要的修改后适用于香草醛生产方法中的酶促反应。通过进行如上所述的转化获得含有香草醛的反应混合物。香草醛的产生和香草醛的收集的确认可以以与上述发酵方法相同的方式进行。也就是说,香草醛生产方法可以进一步包括从反应混合物中收集香草醛的步骤。除香草醛外,收集的香草醛可以含有例如微生物细胞,培养基组分,反应混合物组分,ACAR,水分和微生物的副产物代谢物。收集的香草醛的纯度可以是例如30%(w/w)或更高,50%(w/w)或更高,70%(w/w)或更高,80%(w/w)或更高,90%(w/w)或更高,或95%(w/w)更高。香草酸也可以通过例如使用具有VDC的微生物的生物转化方法或使用VDC的酶促方法转化为愈创木酚。阿魏酸可以通过例如使用具有FDC的微生物的生物转化方法或使用FDC的酶促方法转化为4-乙烯基愈创木酚。4-乙烯基愈创木酚可以通过例如使用具有VPR的微生物的生物转化方法或使用VPR的酶促方法转化为4-乙基愈创木酚。通过这些方法的组合,阿魏酸也可以转化为4-乙基愈创木酚。具体地,阿魏酸可以通过例如与VPR或具有VPR的微生物组合同时或依次使用FDC或具有FDC的微生物,或使用具有FDC和VPR两者的微生物转化为4-乙基愈创木酚。关于香草醛生产方法的上述描述可以在必要的修改后适用于生产其他目标物质的方法。实施例下文,将参考以下非限制性实施例更具体地解释本发明。在本实施例中,从作为亲本菌株的谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC13869)构建具有编码烯醇化酶的NCgl0935基因(eno)的弱化表达的菌株,并且用构建的菌株进行香草酸生产。<1>香草酸脱甲基酶基因缺陷的菌株(FKS0165菌株)的构建已经报道了在棒状杆菌细菌中,香草醛按香草醛->香草酸->原儿茶酸的顺序代谢,并利用(CurrentMicrobiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。从香草酸到原儿茶酸的转化反应由香草酸脱甲基酶催化。vanA基因和vanB基因分别编码香草酸脱甲基酶的亚基A和亚基B。vanK基因编码香草酸摄取系统,并与vanAB基因一起构成vanABK操纵子(M.T.Chaudhry,etal.,Microbiology,2007,153:857-865)。因此,首先通过缺失vanABK操纵子从谷氨酸棒杆菌2256菌株构建目标物质诸如香草醛和香草醛利用能力缺陷的菌株(FKS0165菌株)。程序如下所示。<1-1>用于缺失vanABK基因的质粒pBS4SΔvanABK56的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:51和52的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有vanA基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:53和54的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有vanK基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQIDNO:52和53的序列彼此部分互补。然后,以近似等摩尔量混合含有vanA基因的N端侧编码区的PCR产物和含有vanK基因的C端侧编码区的PCR产物,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔvanABK56。<1-2>FKS0165菌株的构建上面获得的pBS4SΔvanABK56不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域。因此,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SΔvanABK56导入谷氨酸棒杆菌2256菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/LMgSO4-7H2O、0.01g/LFeSO4-7H2O、0.01g/LMnSO4-7H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解物、10μg/L生物素、15g/L琼脂,用NaOH调节到pH7.5),并在31.5℃培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SΔvanABK56掺入基因组中。此一次重组的菌株具有野生型vanABK基因和缺陷型vanABK基因两者。将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基(与CM-Dex琼脂培养基具有相同的组成,只是它不含琼脂)中培养过夜,并将该培养肉汤应用于S10琼脂培养基(100g/L蔗糖,10g/L聚胨,10g/L酵母提取物,1g/LKH2PO4,0.4g/LMgSO4-7H2O,0.01g/LFeSO4-7H2O,0.01g/LMnSO4-4-5H2O,3g/L尿素,1.2g/L大豆蛋白水解物溶液,10μg/L生物素,20μg/L琼脂,用NaOH调节至pH7.5,并在120℃高压灭菌20分钟),并在31.5℃培养。在出现的菌落中,在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA,并使用它用SEQIDNO:55和56的合成DNA作为引物进行PCR,确认了vanABK基因的缺失,并将该菌株命名为FKS0165菌株。<2>醇脱氢酶同源基因缺陷菌株(FKFC14菌株)的构建随后,通过使用谷氨酸棒杆菌菌株FKS0165作为亲本株,通过以下程序构建菌株FKFC14,其是醇脱氢酶同源基因(即NCgl0324基因(adhC)、NCgl0313基因(adhE)、和NCgl2709gene(adhA))缺陷的。<2-1>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的构建<2-1-1>用于缺失NCgl0324基因的质粒pBS4SΔ2256adhC的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:57和58的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl0324基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:59和60的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl0324基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQIDNO:58和59的序列彼此部分互补。然后,将约等摩尔量的含有NCgl0324基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl0324基因的C端侧编码区的PCR产物混合,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)插入已经用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhC。<2-1-2>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的构建由于上述获得的pBS4SΔ2256adhC不含使质粒能够在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SΔ2256adhC导入谷氨酸棒杆菌FKS0165菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认,生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhC掺入基因组中的一次重组菌株。此一次重组菌株具有野生型NCgl0324基因和缺陷型NCgl0324基因两者。将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,将培养肉汤应用到S10琼脂培养基,并在31.5℃进行培养。在出现的菌落中,显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株制备基因组DNA,并用SEQIDNO:61和62的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl0324基因的缺失,并将该菌株命名为FKFC5菌株。<2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313菌株)的构建<2-2-1>用于缺失NCgl0313基因的质粒pBS4SΔ2256adhE的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:63和64的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl0313基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA为模板和SEQIDNO:65和66的合成DNA为引物进行PCR,以获得含有NCgl0313基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQIDNO:64和65的序列彼此部分互补。然后,将约等摩尔量的含有NCgl0313基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl0313基因的C端侧编码区的PCR产物混合,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒,并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhE。<2-2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313株)的构建由于上述获得的pBS4SΔ2256adhE不含有使质粒能够在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,但它在非常低的频率发生。因此,通过电脉冲方法将pBS4SΔ2256adhE导入谷氨酸棒杆菌FKFC5菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃下培养。通过PCR证实,生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SΔ2256adhE掺入基因组中。此一次重组菌株具有野生型NCgl0313基因和缺陷型NCgl0313基因两者。将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,将培养肉汤应用到S10琼脂培养基上,并在31.5℃进行培养。在出现的菌落中,显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株制备基因组DNA,并使用SEQIDNO:67和68的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl0313基因的缺失,并将该菌株命名为FKFC11菌株。<2-3>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709株)的构建<2-3-1>用于缺失NCgl2709基因的质粒pBS4SΔ2256adhA的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:69和70的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有NCgl2709基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA为模板和SEQIDNO:71和72的合成DNA作为引物进行PCR,以得到含有NCgl2709基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQIDNO:70和71的序列彼此部分互补。然后,将约等摩尔量的含有NCgl2709基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl2709基因的C端侧编码区的PCR产物混合,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)插入到用BamHI和PstI处理的pBS4S载体中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒,并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhA。<2-3-2>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709菌株)的构建由于上文获得的pBS4SΔ2256adhA不含能够使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组的菌株作为转化体出现,但它在非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SΔ2256adhA导入谷氨酸棒杆菌FKFC11菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认,生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhA掺入基因组中的一次重组菌株。该一次重组菌株具有野生型NCgl2709基因和缺陷型NCgl2709基因两者。将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,将培养肉汤应用到S10琼脂培养基上,并在31.5℃进行培养。在出现的菌落中,显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株制备基因组DNA,并用SEQIDNO:73和74的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl2709基因的缺失,并将该菌株命名为FKFC14菌株。<3>原儿茶酸双加氧酶基因缺陷菌株(FKFC14ΔpcaGH菌株)的构建随后,通过使用谷氨酸棒杆菌FKFC14菌株作为亲本菌株,通过外包构建菌株FKFC14ΔpcaGH,其是编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的α亚基和β亚基的NCgl2314基因(pcaG)和NCgl2315基因(pcaH)缺陷的。也可以经由以下程序构建FKFC14ΔpcaGH菌株。<3-1>用于缺失NCgl2314和NCgl2315基因的质粒pBS4SΔ2256pcaGH的构建NCgl2314和NCgl2315基因彼此相邻,因此可以一起缺失这些基因。通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:75和76的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有NCgl2315基因的上游区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:77和78的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl2314基因的下游区的PCR产物。SEQIDNO:76和77的序列彼此部分互补。然后,混合近似等摩尔量的含有NCgl2315基因的上游区的PCR产物和含有NCgl2314基因的下游区的PCR产物,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256pcaGH。<3-2>FKFC14ΔpcaGH菌株的构建由于上面获得的pBS4SΔ2256pcaGH不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SΔ2256pcaGH导入谷氨酸棒杆菌FKFC14菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SΔ2256pcaGH掺入基因组中。此一次重组的菌株具有野生型NCgl2314和NCgl2315基因,和缺陷型NCgl2314和NCgl2315基因两者。将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,并将该培养培养基应用于S10琼脂培养基,并在31.5℃培养。在出现的菌落中,在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA,并使用它用SEQIDNO:79和80的合成DNA作为引物进行PCR,确认了NCgl2314和NCgl2315基因的缺失,并将该菌株命名为FKFC14ΔpcaGH菌株。<4>Dp2_0340菌株(FKFC14ΔpcaGHP2::NCgl0120P8::NCgl2048P4::NCgl0935菌株)的构建<4-1>Ap1_0007菌株(FKFC14ΔpcaGHP2::NCgl0120菌株)的构建随后,通过使用谷氨酸棒杆菌FKFC14ΔpcaGH菌株作为亲本菌株,通过外包构建菌株Ap1_0007,其中编码Crp家族表达调节蛋白的NCgl0120基因(cysR)的启动子区已经用P2启动子替换以增强此基因的表达。此菌株中含有P2启动子的基因组区域的核苷酸序列以SEQIDNO:108显示,其中位置942-1034对应于P2启动子。也可以经由以下程序构建Ap1_0007菌株。<4-1-1>用于替换NCgl0120基因启动子的质粒pBS4SP2::NCgl0120的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:81和82的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有NCgl0120基因的上游区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:83和84的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl0120基因的下游区的PCR产物。另外,通过人工基因合成获得含有P2启动子区的SEQIDNO:85的DNA片段。然后,通过使用SEQIDNO:85的DNA片段作为模板,和SEQIDNO:86和87的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有P2启动子的PCR产物。SEQIDNO:82和86的序列彼此部分互补,并且SEQIDNO:83和87的序列彼此部分互补。然后,混合近似等摩尔量的含有NCgl0120基因的上游区的PCR产物、含有NCgl0120基因的N端侧编码区的PCR产物和含有P2启动子的PCR产物,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SP2::NCgl0120。<4-1-2>Ap1_0007菌株的构建由于上面获得的pBS4SP2::NCgl0120不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SP2::NCgl0120导入谷氨酸棒杆菌FKFC14ΔpcaGH菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SP2::NCgl0120掺入基因组中。将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,并将该培养培养基应用于S10琼脂培养基,并在31.5℃培养。在出现的菌落中,在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA,并用于进行核苷酸序列分析以确认P2启动子位于NCgl0120基因上游,并且该菌株命名为Ap1_0007菌株。<4-2>Bp1_0112菌株(FKFC14ΔpcaGHP2::NCgl0120P8::NCgl2048菌株)的构建随后,通过使用谷氨酸棒杆菌Ap1_0007菌株作为亲本菌株,通过外包构建菌株Bp1_0112,其中NCgl2048基因的启动子区已经用P8启动子替换以弱化此基因的表达。此菌株中含有P8启动子的基因组区的核苷酸序列以SEQIDNO:110显示,其中位置901-1046对应于P8启动子。Bp1_0112菌株也可以经由以下程序构建。<4-2-1>用于替换NCgl2048基因启动子的质粒pBS4SP8::NCgl2048的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:112和113的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl2048基因的上游区的PCR产物。分开通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:114和115的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl2048基因的N端侧编码区的PCR产物。另外,通过人工基因合成获得含有P8启动子区的SEQIDNO:116的DNA片段。然后,通过使用SEQIDNO:116的DNA片段作为模板,和SEQIDNO:117和118的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有P8启动子的PCR产物。SEQIDNO:113和117的序列彼此部分互补,并且SEQIDNO:114和118的序列彼此部分互补。然后,混合近似等摩尔量的含有NCgl2048基因的上游区的PCR产物、含有NCgl2048基因的N端侧编码区的PCR产物和含有P8启动子的PCR产物,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SP8::NCgl2048。<4-2-2>Bp1_0112菌株的构建由于上面获得的pBS4SP8::NCgl2048不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SP8::NCgl2048导入谷氨酸棒杆菌Ap1_0007菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SP8::NCgl2048掺入基因组中。将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,将该培养培养基应用于S10琼脂培养基,并在31.5℃培养。在出现的菌落中,在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA,并用于进行核苷酸序列分析以确认P8启动子位于NCgl2048基因上游,并且该菌株命名为Bp1_0112菌株。<4-3>Dp2_0340菌株(FKFC14ΔpcaGHP2::NCgl0120P8::NCgl2048P4::NCgl0935菌株)的构建随后,通过使用谷氨酸棒杆菌Bp1_0112菌株作为亲本菌株,通过外包构建菌株Dp2_0340,其中编码烯醇化酶的NCgl0935基因(eno)的启动子区已经用P4启动子替换以弱化此基因的表达。此菌株中含有P4启动子的基因组区域的核苷酸序列以SEQIDNO:109显示,其中位置872-969对应于P4启动子。Dp2_0340菌株也可以经由以下程序构建。<4-3-1>用于替换NCgl0935基因启动子的质粒pBS4SP4::NCgl0935的构建通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:121和122的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有NCgl0935基因的上游区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO:123和124的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有NCgl0935基因的N端侧编码区的PCR产物。另外,通过人工基因合成获得含有P4启动子区的SEQIDNO:125的DNA片段。然后,通过使用SEQIDNO:125的DNA片段作为模板和SEQIDNO:126和127的合成DNA作为引物进行PCR,以获得含有P4启动子的PCR产物。SEQIDNO:122和126的序列彼此部分互补,并且SEQIDNO:123和127的序列彼此部分互补。然后,混合近似等摩尔量的含有NCgl0935基因的上游区的PCR产物、含有NCgl0935基因的N端侧编码区的PCR产物和含有P4启动子的PCR产物,并通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SP4::NCgl0935。<4-3-2>Dp2_0340菌株的构建由于上面获得的pBS4SP4::NCgl0935不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域,若用该质粒转化棒状杆菌细菌,则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现,尽管它以非常低的频率发生。因此,通过电脉冲法将pBS4SP4::NCgl0935导入谷氨酸棒杆菌Bp1_0112菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并在31.5℃培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株,其中通过同源重组将pBS4SP4::NCgl0935掺入基因组中。将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜,将该培养培养基应用于S10琼脂培养基,并在31.5℃培养。在出现的菌落中,在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA,并用于进行核苷酸序列分析以确认P4启动子位于NCgl0935基因上游,并且该菌株命名为Dp2_0340菌株。<5>用于表达Niastellakoreensis的OMT基因的质粒pVK9::PcspB-omt35的构建通过外包获得质粒pVK9::PcspB-omt35。质粒pVK9::PcspB-omt35含有针对谷氨酸棒杆菌的密码子选择进行密码子优化的Niastellakoreensis的OMT基因。此基因也可以称为“omt35基因”,并且由此基因编码的OMT也可以称为“OMT35”。omt35基因的核苷酸序列以SEQIDNO:135显示,并且OMT35的氨基酸序列以SEQIDNO:131显示。质粒pVK9::PcspB-omt35也可以经由以下程序构建。通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板,和SEQIDNO:132和133的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有cspB基因的启动子区和SD序列的PCR产物。分开地通过人工基因合成获得含有omt35基因的ORF的SEQIDNO:134的DNA片段。然后,通过使用InFusionHD克隆试剂盒(Clontech)将PCR产物和DNA片段插入用BamHI和PstI处理的pVK9载体(WO2007/046389)中。利用该DNA,转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBio),并且将细胞应用于含有100μMIPTG,40μg/mLX-Gal和25μg/mL卡那霉素的LB培养基,并培养过夜。然后,挑取出现的白色菌落,并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒,并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pVK9::PcspB-omt35。<6>香草酸生产菌株的构建通过外包构建谷氨酸棒杆菌Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株(其含有质粒pVK9::PcspB-omt35)。这些菌株也可以经由以下程序构建。通过电穿孔将质粒pVK9::PcspB-omt35导入谷氨酸棒杆菌Bp1_0112和Dp2_0340菌株中。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基,并且于31.5℃培养。在相同的琼脂培养基上纯化培养的菌株,并且分别命名为Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35。将这些菌株各自接种到试管中存在的4mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dexw/omameno培养基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/LMgSO4-7H2O、0.01g/LFeSO4-7H2O、0.01g/LMnSO4-7H2O、3g/L尿素、10μg/L生物素,用KOH调节到pH7.5)中,并且于31.5℃在摇动的情况下培养约16小时。将获得的培养肉汤的0.9mL等分试样与0.6mL50%甘油水溶液混合以获得甘油储液,并且于-80℃贮存。<7>谷氨酸棒杆菌Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的香草酸生产将Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的甘油储液的各5μL等分试样接种到试管中存在的4mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dexw/omameno培养基,并且于31.5℃在摇动的情况下培养20小时作为预培养物。将获得的预培养物肉汤的0.5mL等分试样接种到具有挡板的锥形瓶中存在的50mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dexw/omameno培养基,并且于31.5℃在摇动的情况下培养20小时。以8000rpm将获得的培养物肉汤离心5分钟,除去上清液,并且在经灭菌的生理盐水中悬浮细胞。测量细胞悬浮液的光密度(OD),并且用生理盐水稀释细胞悬浮液以获得600nm处的OD为50。将稀释的细胞悬浮液的5mL等分试样接种到具有挡板的锥形瓶中存在的20mL含有25μg/mL卡那霉素的香草酸生产培养基(75g/L葡萄糖、0.6g/LMgSO4-7H2O、6.3g/L(NH4)2SO4、2.5g/LKH2PO4、12.5mg/LFeSO4-7H2O、12.5mg/LMnSO4-4-5H2O、2.5g/L酵母提取物、150μg/L维生素B1、150μg/L生物素、6.9g/L原儿茶酸,用KOH调节到pH7,然后与37.5g/LCaCO3(用180℃的热空气灭菌3小时)混合)中,并且于31.5℃在摇动的情况下培养24小时。在培养开始和完成时,用Biotech分析仪AS-310(SakuraSI)分析培养基中的葡萄糖浓度。也通过使用超高效液相层析NEXERAX2系统(SHIMADZU)用以下条件分析培养基中的原儿茶酸和香草酸浓度。UPLC分析条件:柱:KINETEX2.6μmXB-C18,150x30mm(Phenomenex)炉温度:40℃流动相(A):0.1%三氟乙酸流动相(B):0.1%三氟乙酸/80%乙腈梯度程度(时间,A(%),B(%)):(0,90,10)->(3,80,20)流速:1.5ml/min表1中显示了结果。对Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株观察到的培养基中的香草酸浓度是对Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株观察到的香草酸浓度的约2.3倍。[表1]表1:谷氨酸棒杆菌香草酸生产菌株的香草酸生产<8>通过定量PCR分析NCgl0935基因(eno)的表达量随后,通过定量PCR分析Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因(eno)表达量。<8-1>RNA的制备将含有细胞的培养肉汤的250μL等分试样与500μLRNAProtectBacteriaReagent(QIAGEN)混合,并且于-80℃贮存,所述培养肉汤对于Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的每种在实施例<7>中在培养开始后5小时获得。于室温融化冷冻的混合物,与200μL含有溶菌酶的TE缓冲液(10mMTris,1mMEDTA,pH8.0)以及与10μL蛋白酶K(20mg/mL)一起添加,混合,然后于室温温育40分钟。使用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN)进行以下程序。将经处理的产物与700μL含有1%2-巯基乙醇的RLT缓冲液一起添加,混合,并且离心以获得上清液。将上清液与500μL乙醇一起添加,混合,并且应用到试剂盒中包含柱,并且将柱离心。用350μLRW1缓冲液清洗柱,然后将80μLDNA酶I溶液添加到柱以于室温进行DNA酶处理15分钟。此外,用350μLRW1缓冲液清洗柱,并且用500μLRPE缓冲液清洗两次,并且用无RNA酶的灭菌水洗脱以获得RNA。使用NanoDrop(ThermoFisherScientific)量化获得的RNA,并且使用BioAnalyer(AgilentTechnologies)用RNA6000Nano试剂盒(AgilentTechnologies)通过进行电泳分析以确认获得的RNA具有足够的纯度。<8-2>通过反向转录合成cDNA使用具有gDNAEraser的PrimeScriptRT试剂试剂盒(TAKARABIO)进行逆转录。将1μgRNA等分试样与1μLgDNAEraser和2μL5×DNAEraser缓冲液一起添加,用灭菌水稀释至总体积10μL,并且于42℃温育2min以降解染色体DNA。将所得的混合物与4μL5×PrimeScriptBuffer2、1μLPrimeScriptRT酶混合物I、1μLRT引物混合物和4μL灭菌水进一步一起添加,于37℃温育15分钟和85℃温育5秒以获得cDNA。<8-3>定量PCR用以下程序从cDNA扩增NCgl0935基因(eno)作为靶基因:2μLcDNA、10μLPowerSYBRGreenPCR主混合物(LifeTechnologies)、SEQIDNO:136和137的引物(各500nM,作为终浓度),并且混合灭菌水以获得总体积20μL;使用7000实时PCR系统(AppliedBioSystems)以95℃变性10分钟,接着95℃达15秒和60℃达1min的40个循环进行PCR。另外,使用与用于靶基因扩增的程序相同的程序从cDNA扩增16SrRNA基因作为持家基因,只是使用2μL32倍稀释的cDNA作为模板并且使用SEQIDNO:138和139。在扩增反应后,PCR产物进行熔解曲线分析以确认PCR产物的一致性。此外,通过琼脂糖凝胶电泳分析PCT产物以确认PCR产物具有用使用的引物可获得的长度。<8-4>表达量的分析使用ΔΔCt方法(METHODS,25,402(2001))来分析NCgl0935基因(eno)的表达量。提供通过从NCgl0935基因(eno)的Ct值扣除持家基因的Ct值获得的数值作为ΔCt值。然而,由于使用32倍稀释(即25倍稀释)的cDNA作为扩增持家基因的模板,作为持家基因的Ct值,使用通过将5加到实际测量的持家基因的ΔCt值获得的值。提供通过从Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的ΔCt值扣除Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35的ΔCt值获得的数值作为ΔΔCt值。基于Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株,Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因(eno)的相对表达量作为2-ΔΔCt计算。表2中显示了结果。Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因(eno)的相对表达量是Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因的相对表达量的低于三十分之一(1/30)。[表2]表2:NCgl0935基因(eno)的相对表达量菌株2-ΔΔCtBp1_0112/pVK9::PcspB-omt351.0Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt350.03[工业适用性]根据本发明,微生物用于生产目标物质,诸如香草醛和香草酸的能力可以得到改善,并且可以有效生产目标物质。<序列表的解释>SEQIDNOS:1:大肠杆菌MG1655的aroG基因的核苷酸序列2:大肠杆菌MG1655的AroG蛋白的氨基酸序列3:大肠杆菌MG1655的aroB基因的核苷酸序列4:大肠杆菌MG1655的AroB蛋白的氨基酸序列5:大肠杆菌MG1655的aroD基因的核苷酸序列6:大肠杆菌MG1655的AroD蛋白的氨基酸序列7:苏云金芽孢杆菌BMB171的asbF基因的核苷酸序列8:苏云金芽孢杆菌BMB171的AsbF蛋白的氨基酸序列9:大肠杆菌MG1655的tyrR基因的核苷酸序列10:大肠杆菌MG1655的TyrR蛋白的氨基酸序列11-14:智人OMT基因的转录物变体1至4的核苷酸序列15:智人OMT同种型(MB-COMT)的氨基酸序列16:智人OMT同种型(S-COMT)的氨基酸序列17:巴西诺卡菌的ACAR基因的核苷酸序列18:巴西诺卡菌的ACAR蛋白的氨基酸序列19:巴西诺卡菌的ACAR基因的核苷酸序列20:巴西诺卡菌的ACAR蛋白的氨基酸序列21:大肠杆菌MG1655的entD基因的核苷酸序列22:大肠杆菌MG1655的EntD蛋白的氨基酸序列23:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的PPT基因的核苷酸序列24:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的PPT蛋白的氨基酸序列25:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的vanK基因的核苷酸序列26:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的VanK蛋白的氨基酸序列27:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的pcaK基因的核苷酸序列28:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的PcaK蛋白的氨基酸序列29:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的vanA基因的核苷酸序列30:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的VanA蛋白的氨基酸序列31:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的vanB基因的核苷酸序列32:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的VanB蛋白的氨基酸序列33:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pcaG基因的核苷酸序列34:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的PcaG蛋白的氨基酸序列35:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pcaH基因的核苷酸序列36:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的PcaH蛋白的氨基酸序列37:大肠杆菌MG1655的yqhD基因的核苷酸序列38:大肠杆菌MG1655的YqhD蛋白的氨基酸序列39:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl0324基因的核苷酸序列40:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl0324蛋白的氨基酸序列41:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl0313基因的核苷酸序列42:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl0313蛋白的氨基酸序列43:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl2709基因的核苷酸序列44:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl2709蛋白的氨基酸序列45:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl0219基因的核苷酸序列46:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl0219蛋白的氨基酸序列47:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl2382基因的核苷酸序列48:谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl2382蛋白的氨基酸序列49:大肠杆菌MG1655的aroE基因的核苷酸序列50:大肠杆菌MG1655的AroE蛋白的氨基酸序列51-84:引物85:含有P2启动子区的DNA片段的核苷酸序列86和87:引物88:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysI基因的核苷酸序列89:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysI蛋白的氨基酸序列90:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysX基因的核苷酸序列91:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysX蛋白的氨基酸序列92:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysH基因的核苷酸序列93:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysH蛋白的氨基酸序列94:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysD基因的核苷酸序列95:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysD蛋白的氨基酸序列96:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysN基因的核苷酸序列97:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysN蛋白的氨基酸序列98:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysY基因的核苷酸序列99:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysY蛋白的氨基酸序列100:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysZ基因的核苷酸序列101:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysZ蛋白的氨基酸序列102:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的fpr2基因的核苷酸序列103:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的Fpr2蛋白的氨基酸序列104:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的cysR基因的核苷酸序列105:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的CysR蛋白的氨基酸序列106:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的ssuR基因的核苷酸序列107:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的SsuR蛋白的氨基酸序列108:含有P2启动子的核苷酸序列109:含有P4启动子的核苷酸序列110:含有P6启动子的核苷酸序列111:含有P8启动子的核苷酸序列112-115:引物116:含有P8启动子区的DNA片段的核苷酸序列117和118:引物119:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl2048基因的核苷酸序列120:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的NCgl2048蛋白的氨基酸序列121-124:引物125:含有P4启动子区的DNA片段的核苷酸序列126和127:引物128:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的eno基因的核苷酸序列129:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的Eno蛋白的氨基酸序列130:Niastellakoreensis的OMT基因的核苷酸序列131:Niastellakoreensis的OMT的氨基酸序列132和133:引物134:含有omt35基因的DNA片段的核苷酸序列135:omt35基因的核苷酸序列(Niastellakoreensis的经密码子优化的OMT基因)136-139:引物序列表<110>味之素株式会社<120>生产目标物质的方法<130>D887-16116<150>US62/413052<151>2016-10-26<160>139<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1053<212>DNA<213>大肠杆菌<400>1atgaattatcagaacgacgatttacgcatcaaagaaatcaaagagttacttcctcctgtc60gcattgctggaaaaattccccgctactgaaaatgccgcgaatacggttgcccatgcccga120aaagcgatccataagatcctgaaaggtaatgatgatcgcctgttggttgtgattggccca180tgctcaattcatgatcctgtcgcggcaaaagagtatgccactcgcttgctggcgctgcgt240gaagagctgaaagatgagctggaaatcgtaatgcgcgtctattttgaaaagccgcgtacc300acggtgggctggaaagggctgattaacgatccgcatatggataatagcttccagatcaac360gacggtctgcgtatagcccgtaaattgctgcttgatattaacgacagcggtctgccagcg420gcaggtgagtttctcgatatgatcaccccacaatatctcgct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再多了解一些
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