针对MELK的单克隆抗体及其使用的制作方法

文档序号:17930476发布日期:2019-06-15 00:48
针对MELK的单克隆抗体及其使用的制作方法

本发明涉及:针对MELK的单克隆抗体、使用上述抗体诊断MELK相关疾病的方法、检测出MELK蛋白质的方法、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效的方法、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的方法、以及包含上述抗体的诊断试剂。



背景技术:

MELK,即母体胚胎亮氨酸拉链激酶(参考序列:Genbank登录号NM_014791.3;SEQ ID NO:21),以前已被认定是参与哺乳动物胚胎发育的snf1/AMPK丝氨酸·苏氨酸激酶家族的新成员(Heyer BS et al.,Dev Dyn.1999 Aug,215(4):344-51(非专利文献1))。结果表明,该基因在干细胞的再生(Nakano I et al.,J Cell Biol.2005 Aug 1,170(3):413-27)、细胞周期的进行(Blot J et al.,Dev Biol.2002 Jan 15,241(2):327-38(非专利文献3);Seong HA et al.,Biochem J.2002 Feb 1,361(Pt 3):597-604(非专利文献4))、以及mRNA前体的剪接(Vulsteke V et al.,J Biol Chem.2004Mar 5,279(10):8642-7.Epub 2003 Dec29(非专利文献4))中发挥重要作用。

此外,通过使用含有23040个基因的全基因组的cDNA微阵列进行的基因表达谱分析,显示MELK在乳腺癌中得到上调(Lin ML et al.,Breast Cancer Res.2007,9(1):R17(非专利文献6)、WO2006/016525(专利文献1)、WO2008/023841(专利文献2))。实际上,MELK在例如:肺癌细胞、膀胱癌细胞、淋巴瘤细胞、宫颈癌细胞这样几种癌细胞中得到上调(参照WO2004/031413(专利文献3)、WO2007/013665(专利文献4)、WO2006/085684(专利文献5))。根据多种人体组织及癌细胞株的Northern印迹分析,证明了:MELK在大部分的乳腺癌或乳腺癌细胞株中以显著更高的水平过度表达,但在正常的重要器官(心脏、肝脏、肺和肾脏)中则不表达(WO2006/016525(专利文献1))。此外,证明了通过siRNA抑制MELK表达,可以显著抑制人乳腺癌细胞的增殖(专利文献1),并且抗MELK小分子抑制剂缩小了小鼠的乳腺癌异种移植片(Chung S et al.,Oncotarget.2012 Dec 3(12):1629-1640(非专利文献7)、Chung S et al.,Oncotarget.2016 Feb 24,7(14):18171-18182(非专利文献)8))。

因此,MELK被认为是抗癌剂的合适靶标,并且可以预测与其对应的单克隆抗体可以在治疗中用作诊断剂。除了针对乳腺癌、恶性淋巴瘤、结肠癌的曲妥珠单抗的诊断剂、利妥昔单抗的诊断剂、以及贝伐单抗的诊断剂这样的单克隆抗体的成功临床应用以外,其他几种针对其他分子靶点的单克隆抗体正在研发中,它们的诊断效果正在评价中。从治疗剂的有效的患者的选择这样的观点出发,期待带来更有效的治疗方法的治疗剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO2006/016525

专利文献2:WO2008/023841

专利文献3:WO2004/031413

专利文献4:WO2007/013665

专利文献5:WO2006/085684

非专利文献

非专利文献1:Heyer BS et al.,Dev Dyn.1999 Aug,215(4):344-51

非专利文献2:Nakano I et al.,J Cell Biol.2005 Aug 1,170(3):413-27

非专利文献3:Blot J et al.,Dev Biol.2002 Jan 15,241(2):327-38

非专利文献4:Seong HA et al.,Biochem J.2002 Feb 1,361(Pt 3):597-604

非专利文献5:Vulsteke V et al.,J Biol Chem.2004 Mar 5,279(10):8642-7.Epub 2003Dec 29

非专利文献6:Lin ML et al.,Breast Cancer Res.2007,9(1):R17

非专利文献7:Chung S et al.,Oncotarget.2012 Dec,3(12):1629-1640

非专利文献8:Chung S et al.,Oncotarget.2016 Feb 24,7(14):18171-18182



技术实现要素:

发明所解决的技术问题

就使用了分子靶向治疗剂的肿瘤治疗中的诊断剂而言,重要的是,检测出在靶肿瘤的大部分中过度表达并且在正常组织中不表达或以最低限度表达的细胞蛋白质。然而,难以以高灵敏度检测出在肿瘤中特异性表达的蛋白质,也难以获得针对这种蛋白质的抗体。例如,关于被认为是抗癌剂的靶标的MELK,市售有数种抗体。然而,当使用本发明人获得的市售的抗体来尝试对MELK表达细胞进行染色时,即使在MELK的表达水平低的细胞中也可以产生阳性信号(假阳性)。如上所述,通过免疫学特异性不充分的抗体,可能无法以抗体的反应强度作为指标而明确地检测出MELK的表达水平的差异。因此,本发明的目的是提供一种以高灵敏度与MELK特异性结合的抗体。

解决问题的技术手段

因此,本发明人在用MELK抗原对小鼠进行免疫而得的单克隆抗体中搜索特异性结合MELK的抗体时,能够特异性结合在细胞中强制表达的MELK蛋白质,并且成功确定了可以特异性且高灵敏度地检测出在细胞或组织中表达的内因性的MELK蛋白质的克隆。

具体而言,本发明涉及:

[1]一种抗体或其抗原结合片段,其能够与MELK蛋白或其部分肽结合,并且包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者,其中,

所述重链可变区包含:

CDR1,其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;

CDR2,其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;以及

CDR3,其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

所述轻链可变区包括:

CDR1,其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;

CDR2,其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;以及

CDR3,其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

[2]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者,其中,

所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

[3]根据[1]或[2]所述的抗体或其抗原结合片段,其特异性识别包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽。

[4]一种抗体或其抗原结合片段,其与[1]~[3]中任一项所述的抗体竞争与MELK的特异性结合。

[5]根据[1]~[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其结合于亲和标记、酶标记、放射性同位素标记或荧光标记。

[6]一种多核苷酸,其编码[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

[7]一种试剂,其包含[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,并且用于诊断MELK相关疾病、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效、或筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象。

[8]一种诊断受试对象中MELK相关疾病或所述疾病的发病原因的方法,其包括以下阶段:

(a)使从所述受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合,来检测出所述样品中的MELK蛋白质的阶段;以及

(c)对所述样品中的MELK蛋白质水平与对照进行比较的阶段,当MELK蛋白质水平高于对照时,表示所述受试对象患有所述疾病或具有其发病风险。

[9]根据[7]所述的试剂或[8]所述的方法,其中,

所述MELK相关疾病是表达MELK的癌症或子宫内膜异位症。

[10]根据[9]所述的试剂或方法,其中,

所述癌症选自乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)。

[11]一种检测出样品中的MELK蛋白质的方法,其包括以下阶段:

(a)使从受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;以及

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合,来检测出所述样品中的MELK蛋白质的阶段。

[12]一种判定受试对象中通过MELK抑制剂治疗后的药效的方法,其包含以下阶段:

(a)使从所述受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合,来检测出所述样品中的MELK蛋白质的阶段;

(c)对所述样品中的MELK蛋白质水平与给药前的表达水平进行比较的阶段,当MELK蛋白质水平低于给药前的水平时,表示对所述受试对象具有药效。

[13]一种筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的方法,其包括以下阶段:

(a)使从所述受试对象分离的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合,来检测出所述样品中的MELK蛋白质的阶段;

(c)对所述样品中的MELK蛋白质水平与对照进行比较的阶段,当MELK蛋白质水平与对照相同或在其以上时,表示对所述受试对象通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高。

[14]根据[8]~[13]中任一项所述的方法,其中,

所述样品是从所述受试对象分离得到的细胞或组织。

[15]一种制造能够与MELK蛋白质或其部分肽结合的抗体的方法,其包括以下工序:

(a)培养包含导入有[6]中所述的多核苷酸的载体的细胞;以及

(b)从所述细胞的培养物或培养基中回收所述抗体。

本发明还涉及:

[16]一种检测出MELK相关疾病或该疾病的发病原因的诊断标记物的方法,其包括以下阶段:

(a)使从上述受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;以及

(b)通过检测出上述抗体或抗原结合片段与上述样品的结合,来检测出上述样品中的MELK蛋白质作为上述标记物的阶段。

[17]根据[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其用于MELK相关疾病或该疾病的发病原因的诊断。

[18]一种用于诊断MELK相关疾病或该疾病的发病原因的试剂的制造中的、[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的使用。

[19]一种检测出MELK抑制剂的药效标记物的方法,其包括以下阶段:

(a)使从上述受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;以及

(b)通过检测出上述抗体或抗原结合片段与上述样品的结合,来检测出上述样品中的MELK蛋白质作为上述标记物的阶段。

[20]根据[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其用于通过MELK抑制剂进行治疗后的药效判定。

[21]一种用于判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效的试剂的制造中的、[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的使用。

[22]一种检测出MELK抑制剂治疗应答性标记物的方法,其包含以下阶段:

(a)使从上述受试对象分离得到的样品与[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触;以及

(b)通过检测出上述抗体或抗原结合片段与上述样品的结合,来检测出上述样品中的MELK蛋白质作为上述标记物。

[23]根据[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其用于筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象。

[24]一种用于筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的试剂的制造中的、[1]~[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的使用。

除了上述之外,当结合附图或实施例并阅读以下详细说明时,本发明的其他目的和特征变得更明显。然而,上述的发明内容或以下详细的说明都是示例性实施方式,并不限制本发明或本发明的其他替代性实施方式。特别是,尽管本发明说明书中参考若干具体的实施方式来对本发明进行说明,但上述说明仅为本发明的例证,而不对本发明进行限定。在不脱离添附的权利要求所记载的本发明的精神或范围的情况下,本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样,根据本发明内容或下面说明中记载的特定实施方式,本发明的其他目的、特征、权利、优点变得明显,并且对本领域技术人员而言是容易理解的。上述目的、特征、权利、优点可以与添附的实施例、数据、图表、以及由此引申而得的任何合理推论进行组合,如上所述,单独或考虑到本发明说明书中引用的参考文献而变得明显。

附图说明

[图1]图1是表示使用了强制表达类细胞株的免疫组织化学染色中抗MELK抗体(OTSMAb01)的特异性的显微照片。通过抗MELK抗体(OTSMAb01)进行免疫组织化学染色的结果,在由MELK强制表达细胞株(MELK/293T)制得的石蜡样品中观察到特异性染色,但在导入有空载体作为阴性对照的细胞株(Mock/293T)中没有染色。另一方面,用市售的抗体(MELK(N449)pAb(Bioworld Technology)、MELK(HPA017214)pAb(Sigma-Aldrich))进行免疫组织化学染色的结果,也在MELK/293T中观察到特异性染色,但在Mock中没有染色。此外,照片底部的图表表示,由免疫组织化学染色的结果计算出的MELK阳性细胞在强制表达细胞数中所占的比例(%)。

[图2A]图2AB是表示使用了OTSMAb01的蛋白质印迹结果的照片,该结果表示在MELK表达量不同的各种细胞株中MELK的表达。PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549是MELK高表达细胞株,MCF-7、HepG2、HT-29是MELK低表达细胞株。

[图2B]图2B表示图2A的后续部分。

[图3A]图3AB是表示使用了MELK表达细胞株的免疫组织化学染色中抗MELK抗体(OTSMAb01)的特异性的显微照片。作为上方面板的通过本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)进行免疫组织化学染色的结果,在由PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549等MELK高表达细胞株制得的石蜡切片中观察到染色,但在MCF-7,Hep G2和HT-29等低表达细胞株中几乎未染色。另一方面,作为中间面板与下方面板的通过市售抗体(MELK(N449)pAb、MELK(HPA017214)pAb)得到的结果,在MELK高表达细胞株与低表达细胞株中均观察到染色。通过使用了细胞株的分析,明显可以发现:与市售抗体相比,本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)的免疫组织化学染色法具有高特异性。此外,照片下方的图表表示根据免疫组织化学染色的结果计算而得到的MELK阳性细胞在各细胞株中所占的比例(%)。

[图3B]图3B表示图3A的后续部分。

[图4]图4表示使用了乳腺癌临床样本1~3的免疫组织化学染色与半定量RT-PCR中表达的相关。A:通过使用了本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)的免疫组织化学染色,在所有乳腺癌样本中观察到MELK阳性结果。另一方面,在正常乳腺样本中几乎没有染色。B:表示根据免疫组织化学染色的结果计算得到的MELK阳性细胞数在肿瘤细胞中所占的比例的图表。C:通过相同病例的RT-PCR的表达分析而得到与免疫组织化学染色相关的结果。通过使用临床样本分析,可以明显发现,本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)的免疫组织化学染色具有高特异性。

具体实施方式

详细的说明

当对实施本发明的方式或实施方式进行试验时,可以使用与本说明书中记载的方法和材料类似或等同的任意的方法和材料,本说明书中记载了优选的方法、装置、材料。然而,在记载本发明的材料与方法之前,可以按照常规的实验方法以及最优化的目的来改变本说明书中所述的特定大小、形状、尺寸、材料、方法、方案等,并且本发明不限于这些。应当理解:本说明书中使用的专业术语仅用于说明特定的类型或实施方式,并不用于限制本发明的范围,本发明的范围仅受添附的权利要求的范围的限制。

本发明提供了可以与MELK蛋白质或其部分肽特异性结合的抗MELK单克隆抗体。本发明提供证据表明,本发明的抗MELK单克隆抗体在免疫组织化学染色中MELK蛋白质的检测中具有高特异性。

本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)至少在可变区具有以下氨基酸序列。

OTSMAb01,重链可变区氨基酸序列(信号序列除外):

EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGIDGIGWIDPEGNTTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLSSLTSEDAVYCTSHHYSAMDYWGQGTSTVSS(SEQ ID NO:7)

OTSMAb01,轻链可变区氨基酸序列(信号序列除外):

DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGPDFSGSGSDFTSLIISRVEEDLVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLEKRAD(SEQ ID NO:8)

本发明的抗体可以通过使用编码上述氨基酸序列的DNA的重组技术来制备。

本发明的抗体如下进行筛选而选择出具有与MELK的结合性的抗体:通过免疫染色法,从通过免疫接种小鼠而得到的多个抗体产生杂交瘤中,获得通过强制表达细胞(阳性对照细胞)而表现阳性并且通过阴性对照细胞而表现阴性的抗体。在所选抗体中,进一步选择通过内因性MELK表达细胞(阳性对照细胞)而表现阳性并且通过阴性对照细胞而表现阴性的抗体。当与MELK的相互作用不是很强时,将具有弱结合力的抗体作为背景。因此,通过使用预先测定了内因性MELK表达量的细胞株进行免疫染色和筛选,可以选择与目标MELK具有强结合性的抗体。

本发明的抗体与MELK特异性结合。因此,本发明的抗体可以用作用于检测出MELK或者表达了MELK的细胞或组织的工具。此外,本发明的抗体可以用作与能够检测出上述抗体的标记结合的标记体,上述标记体更优选能够检测出例如直肠癌等的表达MELK的癌细胞或癌组织。作为与本发明的抗体结合的标记,可以是能够检测出与MELK结合的抗体的标记,可举出:亲和标记(例如,生物素、抗生物素蛋白等)、酶标记(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(例如,FITC、罗丹明等)等。

当本发明的抗体用作选择癌症治疗患者的诊断剂时,可以原样使用本发明的抗体,也可以制成适合各种使用形态的组合物。

I、定义

就本说明书中所用的词语“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”而言,除非特别说明,否则意味着“至少一个”。

关于物质(例如,肽、抗体、多核苷酸等)而使用的术语“分离得到的”以及“纯化得到的”若不是该物质,则表示实际上不包含天然来源中的物质中所包含的至少一种物质。因此,分离得到的或纯化得到的抗体是指,实际上不包含来源于该抗体的细胞或组织中的其他细胞材料的抗体,上述细胞材料包括:糖质、脂质、其他的混入蛋白质。在优选的实施方式中,本发明的抗体经过了分离或纯化。

术语“多肽”和“蛋白质”在本说明书中可互换使用,是指氨基酸残基的聚合物。除了天然型氨基酸聚合物之外,上述术语也适用于包含一个或多个非天然型氨基酸残基的非天然型氨基酸聚合物。非天然型氨基酸包括氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”在本说明书中可互换使用,是指核苷酸的聚合物。

除非特别说明,术语“MELK相关疾病”是指表达MELK的癌症或子宫内膜异位症。

除非特别说明,术语“癌症”是指过度表达MELK基因的癌症,例如可举出:乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)等,但不限于此。

本说明书中所用的术语“抗体”主旨包含,对于指定的蛋白质或其肽具有特异反应性的免疫球蛋白或其片段。抗体可包含与其他的蛋白质或标记融合的抗体和抗体片段。此外,在本说明书中,抗体以最广泛的意义进行使用,具体而言,只要其表现出所期望的生物活性,就包括:完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体构成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体)或抗体片段。“抗体”是指所有的类别(例如,IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。

“抗体片段”是完整的抗体的一部分,通常包含完整的抗体的一个或多个抗原结合区或可变区。因此,在本发明中,抗体片段可包含完整的抗体的一个或多个抗原结合部分。本说明书中所用的术语,即抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合性片段”是指,抗体的一个或多个免疫活性片段,其保持有与抗原(例如MELK)特异性结合的能力。抗体的抗原结合能力表现为可以通过全长抗体的片段进行。作为抗体片段的实例包括:Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、直链状抗体、单链抗体分子。无论结构如何,抗体片段都与完整抗体所识别的抗原相同的抗原结合。术语“抗体片段”包含与特异性抗原结合的合成多肽或基因工程多肽,例如可举出:由轻链可变区构成的多肽、由重链和轻链可变区构成的“Fv”片段、轻链和重链可变区通过肽接头连接而成的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)、包含模拟高变区的氨基酸残基的最小识别单元。

除非特别说明,否则本说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属的技术领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

在本发明中,例如可以通过抗体之间的竞争来评价MELK蛋白质与抗体的特异性结合。具体而言,作为本发明的抗体,例如,可以将包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体作为参照抗体,来评价候补抗体的特异性。代表性的参照抗体是OTSMAb01。在参照抗体与人MELK蛋白质之间的抗原抗体反应中,当候补抗体参与竞争时,可以确认候补抗体具有与参照抗体相同的特异性。例如,就在候补抗体不存在下与MELK蛋白质结合的抗体的量而言,当参照抗体在候补抗体的共存下与MELK蛋白质反应时,在10%、20%、30%或40%、更优选50%或以上的参照抗体的结合受到抑制的情况下,可以确定抗体之间发生竞争。不仅是MELK蛋白质,只要与参考抗体结合就能够使用部分肽来评价抗体之间的竞争。优选的部分肽是,例如由SEQ ID NO:9的氨基酸序列构成的部分肽。

II、抗体的产生

在本发明中,使用抗MELK单克隆抗体。通过本领域公知的方法提供上述抗体。

下面将记载本发明中使用的示例性抗体产生技术。

(i)单克隆抗体

单克隆抗体实际上从均质的抗体群中得到。即,除了可能少量存在的天然突变外,构成抗体群的各个抗体是相同的。因此,“单克隆”这个修饰语表示抗体不是与个别抗体形成的混合物的特征。

例如,单克隆抗体可以使用Kohler et al.,Nature,256:495(1975)中首次记载的杂交瘤法来产生,也可以通过重组DNA法来产生(US4816567号)。

在杂交瘤法中,可以用小鼠或其他合适的宿主动物,例如通过MELK多肽(MELK蛋白质或其部分多肽)对仓鼠等进行免疫,以产生与MELK多肽特异性结合的抗体或诱导可以产生的淋巴细胞。或者,可以通过MELK多肽对淋巴细胞进行体外免疫。然后,使用聚乙二醇等合适的融合剂,将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。

将制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中播种并使其在培养基中增殖,上述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞增殖或存活的物质。例如,亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)时,在用来培养杂交瘤的培养基中,通常可包含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷(HAT培养基),通过这些物质阻碍HGPRT缺陷细胞的增殖。

优选的骨髓瘤细胞是下述细胞:进行有效融合,辅助通过所选择的抗体产生细胞的稳定且高水平的抗体产生,并且具有对HAT培养基等培养基的敏感性的细胞。优选的骨髓瘤细胞株包含:小鼠骨髓瘤细胞株,例如可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA获得的MOPC-21与来自MPC-11小鼠肿瘤的细胞株;以及可从American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA获得的SP-2细胞和X63-Ag8-653细胞。关于人单克隆抗体的产生,记载了人骨髓瘤细胞株和小鼠-人异源骨髓瘤细胞株(Kozbor,J.Immunol.,133:300 1(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

对繁殖有杂交瘤细胞的培养基,对抗原的单克隆抗体的产生进行分析。优选的是,杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性,通过免疫沉淀法或通过放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)等体外结合测定来进行确定。

单克隆抗体的结合亲和性例如可以通过Munson et al.,Anal Biochem.107:220-39(1980)的3D Scatchard分析进行判定。

确定产生具有所期望的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞,然后,可通过有限稀释法来亚克隆上述克隆,并通过标准方法进行增殖(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。适用于上述目的的培养基的实例包括D-MEM培养基或RPMI1640培养基。此外,杂交瘤细胞可以在动物体内通过腹水肿瘤进行增殖。

通过亚克隆分泌的单克隆抗体可以纯化至同质。例如,可以根据用于一般蛋白质的分离法和纯化法,进行抗体的分离和纯化。不限于上述方法,例如可以通过适当选择及组合使用亲和色谱法等柱层析法、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等,从培养基、腹水或血清中适当地分离与分离抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。可以使用蛋白A柱与蛋白G柱作为亲和柱。应该可以使用的示例性蛋白A柱包括,例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F(Pharmacia)等。

在示例性色谱法中,除亲和色谱法之外,还包含例如离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤法、反相色谱法、吸附色谱法等(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。色谱法的程序可以通过HPLC和FPLC等液相色谱法来进行。

就编码单克隆抗体的DNA而言,使用传统的步骤(例如,通过使用能够与编码小鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离并确定序列。杂交瘤细胞可用作这种DNA的优选的供给源。对DNA进行分离后,将其导入表达载体中,然后,将其转染至不通过其他方法产生免疫球蛋白质的大肠杆菌(E.coli)细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞等宿主细胞中,可以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。在关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章中,包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)与Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

用于产生对MELK显示反应性的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是:将编码在细菌中表达的免疫球蛋白基因或其一部分的表达库,使用MELK蛋白质或其部分肽进行筛选。例如可以使用噬菌体表达库在细菌中表达完整的Fab片段、VH区、Fv区等。例如参见Ward et al.,Nature 341:544-546(1989);Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989);以及,McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)。例如,使用MELK肽来筛选上述库,由此可以确定对MELK具有反应性的免疫球蛋白片段。或者,可以使用SCID-hu小鼠(可从Genpharm获得)用于产生抗体或其片段。

在其他的实施方式中,可以使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中记载的技术并从制得的抗体噬菌体库中对抗体或抗体片段进行分离。在Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)与Marks et al.,J MoL BioL,222:581-597(1991)中,分别记载了使用了噬菌体库的小鼠抗体和人抗体的分离。随后的出版物中,记载了通过链改组的高亲和性(nM范围)人抗体的产生(Marks et al.,BioTechnology,10:779-783(1992))、以及作为用于构建非常大的噬菌体库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))。这些技术是用于单克隆抗体分离的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代方案。

本发明提供适用于诊断MELK相关疾病、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的抗体。本发明成功地建立了能够在免疫组织化学染色中以高特异性检测出MELK蛋白质的小鼠单克隆抗体克隆(OTSMAb01)。当该抗体克隆用于乳腺癌临床样品的免疫组织化学染色时,在乳腺癌样品中观察到阳性结果,但在正常乳腺样品中几乎不染色。此外,当使用市售的抗MELK抗体时,在由MELK高表达细胞株、低表达细胞株制得的样品中均观察到染色,对此,当使用本发明的抗MELK抗体时,在由MELK高表达细胞株制得的样品中有明显的特异性染色。这样的具有高抗原特异性的本发明的抗体,有利于选择具有高MELK表达水平的患者,并且有利于选择通过MELK抑制剂进行的治疗有效性可能较高的患者。

本发明的抗MELK小鼠单克隆抗体克隆(OTSMAb01)的重链可变区(H链V区)与轻链可变区(L链V区)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8。

包含在重链可变区与轻链可变区中的CDR(互补决定区)可以根据本领域的公知方法进行确定。例如,由Kabat等(Kabat E.A.et al.,(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest.5th Edition)或Chothia等(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196;901-917)记载的方法一般用于关于CDR的确定。由Kabat的定义确定的本发明的抗MELK小鼠单克隆抗体克隆(OTSMAb01)的重链可变区的CDR1、2、3分别示于SEQ ID NO:1、2、3,以及该克隆的轻链可变区的CDR1、2、3,分别示于SEQ ID NO:4、5、6。

因此,本发明提供一种抗体或其抗原结合片段,其能够与MELK蛋白或其部分肽结合,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区与轻链可变区中任意一者或两者,其中,

所述重链可变区包含:

CDR1,其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;

CDR2,其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;以及

CDR3,其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

所述轻链可变区包括:

CDR1,其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;

CDR2,其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;以及

CDR3,其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在本发明中,本发明的抗体所结合的MELK蛋白质的部分肽优选包含MELK蛋白质(SEQ ID NO:22)的第264位~第601位对应的氨基酸序列(SEQ ID NO:9),并且由选自SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的氨基酸序列构成。更优选的是,本发明中MELK蛋白质的部分肽可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

上述包含“CDR1,其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;CDR2,其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;以及CDR3,其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列”的重链可变区的一个实例是,包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的重链可变区。上述包含“CDR1,其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;CDR2,其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;以及CDR3,其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列”的轻链可变区的一个实例是,包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

因此,在一个实施方式中,本发明提供一种抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区或轻链可变区中的任意一者或两者,其中,上述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,上述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

本发明的抗体可通过常规方法进行制备。例如,可以根据常规基因重组技术,将编码抗体多肽的多核苷酸导入合适的载体中,将上述载体导入宿主中,并从上述宿主产生抗体,由此来制备抗体(例如参照Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-75)。

编码本发明的抗体的可变区(V区)的多核苷酸的核酸序列,可以从本发明的抗体的V区的氨基酸序列中推定。作为编码本发明的抗体克隆的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)的核酸序列,例如可以分别使用SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11中所示的核酸序列。编码本发明的抗体的V区的多核苷酸,可以通过固相合成技术(Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron(1992)48,2223-311;Matthes et al.,EMBO J(1984)3,801-5)与寡核苷酸合成技术(Jones et al.,Nature(1986)321,522-5)这样的常规方法并基于序列信息进行合成。

将编码抗体V区的多核苷酸导入含有编码抗体恒定(C)区的多核苷酸的表达载体中。

为了产生本发明中使用的抗体,将编码上述抗体(抗体基因)的多核苷酸导入表达载体中,并且使得抗体基因可以在表达控制要素(例如,增强子、启动子)的控制下进行表达。使用表达载体,转化宿主细胞,并表达抗体。

在抗体基因的表达中,可以将编码抗体的H链的多核苷酸与编码L链的多核苷酸导入不同表达载体中,然后将得到的重组表达载体同时转化到宿主细胞中。或者,可以将编码抗体的H链的多核苷酸与编码L链的多核苷酸两者一起导入单个表达载体中,然后将得到的重组表达载体转化到宿主细胞中(例如,WO94/11523号)。

抗体基因可以通过公知的方法进行表达。在哺乳动物细胞中进行表达时,可以将常规的有用的启动子、被表达的抗体基因、poly(A)信号(位于抗体基因的3’末端的下游)进行功能性连接。例如,可以使用人巨细胞病毒早期启动子/增强子系统作为有用的启动子/增强子系统。

其他启动子/增强子系统,例如源自病毒(例如,逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40))的启动子/增强子系统、源自哺乳动物细胞的启动子/增强子系统(例如,人延伸因子1α(HEF1α))也可以用于本发明中抗体的表达。

当使用SV40启动子/增强子系统时,可以通过Mulligan等(Nature(1979)277,108-14)的方法容易地进行基因表达。当使用HEF1α启动子/增强子系统时,可以通过Mizushima等(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)的方法容易地进行基因表达。

在大肠杆菌中进行表达时,可以将常规的有用的启动子、用于分泌关注对象的抗体的信号序列、抗体基因进行功能性连接。可以使用lacZ启动子或araB启动子作为启动子。当使用lacZ启动子时,可以通过Ward等(Nature(1986)341,544-6.;FASBE J.(1992)6,2422-7)的方法进行基因表达,另一方面,当使用araB启动子时,可以通过Better等(Science(1988)240,1041-3)的方法进行基因表达。

关于用于抗体分泌的信号序列,当关注对象的抗体意图分泌到大肠杆菌的细胞间隙中时,可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-83.)。对分泌到细胞间隙中的抗体进行分离,然后将抗体再次折叠并且使抗体具有适当的立体结构。

可以使用源自病毒(例如,SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV))等的复制起点。为了提高宿主细胞株中的基因拷贝数,在表达载体中,还可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等选择标记基因。关于本发明中使用的抗体的产生,可以使用包含真核生物和原核生物的细胞系统的任意表达系统。真核生物细胞包括动物(例如,哺乳类、昆虫、霉菌与真菌、酵母)的构建细胞株。原核生物细胞包括大肠杆菌细胞等细菌细胞。本发明中使用的抗体优选在CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、Vero细胞、HeLa细胞等哺乳动物细胞中进行表达。

然后,在体外或体内培养转化而得的宿主细胞,以产生关注对象的抗体。宿主细胞的培养可以通过任何公知的方法进行。本说明书中使用的培养基可以是DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM培养基。培养基可包含胎牛血清(FCS)等血清补充剂。

在重组抗体的产生中,除了上述宿主细胞外,也可以用转基因动物作为宿主。例如,将抗体基因插入编码动物乳汁中原本产生的蛋白质(例如β酪蛋白)的基因的指定位点,来制备融合基因。将含有导入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入非人动物的胚胎中,然后将上述胚胎导入雌性动物体内。体内具有上述胚胎的上述雌性动物生出转基因非人动物。关注对象的抗体从上述转基因非人动物或其后代分泌到母乳中。为了增加含有上述抗体的母乳的量,可以向上述转基因动物给药适当的激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。

可以将以上述方式表达并产生的抗体从细胞或宿主动物的体内分离、纯化。本发明中使用的抗体的分离和纯化可以在亲和柱上进行。也可以使用常规用于抗体的分离和纯化的其他方法,因此,方法没有特别限定。例如,可以单独或组合使用各种色谱、过滤、超滤、盐析、透析等,来分离和纯化关注对象的抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。

(ii)抗体片段

已经开发了各种技术用于产生抗体片段。以往,这些片段是通过分解消化完整抗体的蛋白质而获得的(例如参照Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)与Brennan et al.,Science,229:81(1985))。然而,现在可以通过重组宿主细胞来直接产生这些片段。例如,可以从抗体噬菌体库中对抗体片段进行分离。或者,可以直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段,并进行化学偶联,以形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法,可以直接从重组宿主细胞培养物中对F(ab’)2片段进行分离。用于产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员而言是显而易见的。在另一实施方式中,最合适的抗体是单链Fv片段(scFv)。参照WO93/16185号;US5571894号;与US5587458号。此外,抗体片段也可以是例如,US5641870号中记载的“直链状抗体”。此类直链状抗体片段可具有单一特异性或双重特异性。

(iii)标记化抗体

本发明的抗体任意与亲和标记、酶标记、放射性同位素标记、荧光标记、化学发光标记结合。例如,根据存在于表达MELK的癌内部并且可检测出的标记的存在,可以判定待诊断受试对象中癌症或肿瘤的有无。此外,通过肿瘤内部的标记的局部存在性,也可以判定疾病的扩大。

适合使用的标记例如包括荧光素与罗丹明等荧光标记;荧光素酶等酶标记。所使用的可检测的/检测用的标记,根据所使用的成像模式进行选择。可以使用本领域公知的方式和技术来制备这些标记与抗体形成的结合体。在本发明中,本发明的抗体可以在使用前立即与所期望的标记结合,也可以提供与标记结合而成的抗体。

就抗体与标记形成的结合体而言,可以使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双官能性衍生物(例如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)、双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)等各种双官能性蛋白质偶联剂来进行制备。或者,可以通过例如重组技术或肽合成,来制备包含抗体及标记的融合蛋白质。作为这样的融合蛋白质的优选实例,可列举:ECFP、EYFP、EGFP等标记蛋白质与抗体形成的融合蛋白质。

III.MELK相关疾病的诊断、通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的筛选(治疗前诊断)、或通过MELK抑制剂进行治疗后的药效的判定(治疗后诊断)

MELK可用作MELK相关疾病的诊断标记物,也可用作对上述疾病对于MEELK抑制剂的响应性和上述抑制剂的药效进行评价的标记物。因此,本发明的抗体可用作下述标记物的检测试剂,该标记物用于诊断癌症等MELK相关疾病、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象、或判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效。

更具体而言,通过本发明的抗体检测出从受试对象分离的样品中的MELK蛋白质,可以诊断MELK相关疾病、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象、或判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效。因此,就本发明而言,通过使用本发明的抗体从受试对象分离得到的样品中检测出MELK蛋白质,从而提供了诊断受试对象中MELK相关疾病或上述疾病的发病因素的方法、筛选MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象方法、以及判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效的方法。这些方法包括以下阶段:

(a)使从受试对象中分离得到的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触的阶段;

(b)通过检测出上述抗体或其抗原结合片段与上述样品的结合,来检测出上述样品中的MELK蛋白质的阶段;以及

(c)将上述样品中的MELK蛋白质水平与对照进行比较的阶段。

在经典的实施方式中,上述样品是从上述受试对象分离的细胞或组织,优选是从上述受试对象分离的组织。因此,本发明的各方法通常都对从受试对象分离的样品在体外(in vitro)实施。通过活体检查(活检)或采血等技术从受试对象中分离组织或细胞的技术是公知的。或者,可以利用通过用于治疗的医疗处理(外科手术等)从受试对象取出的生物样品。在与抗体接触之前,还可以对从受试对象分离的细胞或组织进行适当处理。例如,通常将从受试对象获得的组织样品在冷冻后进行切片,并进一步通过酒精、福尔马林等进行固定,可以作为用于免疫组织学分析的样品。或者,在用福尔马林等对组织样品或培养细胞等进行固定,然后,可以将其包埋在石蜡中以获得用于免疫组织学分析的切片。

可以通过本领域技术人员公知的方法检测出本发明的抗体或其抗原结合片段与样品的结合,即与样品中抗原蛋白质的结合。更具体而言,在将本发明的抗体与上述样品接触后,通过洗净除去样品中未与MELK蛋白质结合的物质,随后检测出样品中残留的抗体,由此可以检测出本发明的抗体与样品中的MELK蛋白质的结合。此时,当抗体被直接标记时,可以通过检测出标记来检测出与MELK蛋白质结合的本发明的抗体的存在。如果标记是酶、荧光物质、发光物质、粒子等可检测出的标记,则可以立即检测出这些标记。此外,当用生物素等亲和物质(结合性物质)标记本发明的抗体时(亲和标记),可以通过标记抗生物素蛋白等结合配体来捕获抗体的存在。或者,当本发明的抗体未被直接标记时,可以通过针对抗体的结合试剂来检测出本发明的抗体。例如,作为抗体结合试剂,可以对蛋白质A或抗体标识抗体并用于抗体的检出。

在诊断MELK相关疾病时,在上述阶段(c)中,当与对照水平(正常对照水平,优选从未患MELK相关疾病的健康受试对象中分离的样品中MELK蛋白质的表达水平)相比MELK蛋白水平较高时,表示受试对象患有MELK相关疾病或有发生MELK相关疾病的风险。

此外,筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象时,在上述阶段(c)中,当与对照水平(优选被诊断患有MELK相关疾病的受试对象的组织中的MELK蛋白质的表达水平)相比MELK蛋白质水平相同或更高时,表示MELK抑制剂在受试对象中具有较高的治疗效果。

另一方面,在判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效时,在上述阶段(c)中,当与对照水平(优选从给药前的受试对象中分离得到的样品中MELK蛋白的表达水平)相比MELK蛋白质水平较低时,表示在受试对象中具有药效。

通过本发明的诊断方法,表示为具有MELK相关疾病的患者成为通过MELK抑制剂的治疗对象的可能性较高。因此,根据本发明的诊断方法,可以将MELK抑制剂给药到显示具有MELK相关疾病的患者。或者,显示通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的患者也可以通过筛选并给药MELK抑制剂。并且,在接受了MELK抑制剂的给药的患者中,即使已经表示具有上述抑制剂产生的治疗效果,也可以继续对同一患者给药MELK抑制剂。

即,本发明涉及治疗MELK相关疾病的方法,其包括下述工序:通过本发明的方法,选定选自下组的任意患者,并对该患者给药MELK抑制剂。

通过本发明的诊断方法,显示为患有MELK相关疾病的患者;

显示通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的患者;以及

接受了MELK抑制剂的给药的患者中,已经具有该抑制剂产生的治疗效果的患者。

在本发明中,可以使用公知的化合物作为给药到患者的MELK抑制剂。例如,公知有:各种抑制MELK的酶促作用的化合物(WO2012/016082、WO2013/109388、Oncotarget.2012,3:1629-1640,Oncotarget.2016;7:17652-17664)。

在本发明的相关内容中,从被认为不患有MELK相关疾病(例如,非癌性)的生物样品中测得的对照水平被称为“正常对照水平”。当从受试对象中分离的样品中的MELK蛋白质水平与正常对照水平相比较高时,可以诊断为受试对象患有应该接受治疗的MELK相关疾病。

另一方面,从被认为患有MELK相关疾病(例如,癌性)的生物样品中测得的对照水平被称为“疾病对照水平(例如,癌性对照水平)”。当从MELK抑制剂治疗前的受试对象中分离的样品中的MELK蛋白质水平与疾病对照水平相比相同或较高时,可以诊断为受试对象通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高。

此外,当从通过MELK抑制剂治疗后的受试对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质水平低于给药前的相同受试对象的疾病对照水平时,可以诊断为具有治疗的药效,即受试对象通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高。

在特定的实施方式中,也可以将从患有应该治疗的MELK相关疾病(例如,癌)的器官的非患病区域(例如,非癌性区域)获得的正常细胞(或组织)作为正常对照。在另一实施方式中,对照水平可以基于分析源自被认为处于疾病状态(例如,癌性或非癌性)的受试对象的样品中预先测得的MELK蛋白质水平得到的结果,通过统计的方法来进行确定。此外,对照水平可以从源自先前进行了试验的样品(细胞或组织)的表达模式的数据库中得到。当作为评价对象的样品是组织样品时,优选使用源自相同组织的样品作为对照样品。

此外,根据本发明的一个实施方案,可以将生物样品中的MELK蛋白质水平与从多个参照样品中测得的多个对照水平进行比较。优选与源自受试对象的生物样品的组织类型相似的组织类型来源的参照样品,并使用从该参考样品中测得的对照水平。此外,优选使用在明确了疾病状态的群体中的MELK蛋白质水平的基准值。可以通过本领域公知的任何方法获得基准值。例如,可以使用平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围作为基准值。

当样品中的MELK蛋白质的水平比对照水平例如高10%、高25%或高50%、或者大于对照水平的1.1倍、大于其1.5倍、大于其2.0倍、大于其5.0倍、大于其10.0倍或以上时,可认为样品中的MELK蛋白质的水平较高。当样品中的MELK蛋白质的水平比对照水平例如低10%、低25%或低50%、或者低于对照水平的1/1.1、低于其1/1.5、低于其1/2.0、低于其1/5.0、低于其1/10.0或以下时,可认为样品中的MELK蛋白质的水平较低。

在经典的实施方式中,MELK相关疾病是表达MELK的癌症或子宫内膜异位症。表达MELK的癌症为例如:乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓性白血病(CML)、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌或小细胞肺癌(SCLC)等,但并不限定于此。

在其他实施方式中,本发明提供检测出MELK相关疾病或该疾病的发病因素的诊断标记物的方法,其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测出样品中的MELK蛋白质作为诊断标记物的阶段。已知:与正常组织相比,MELK在某些类型的癌细胞中的表达增强。因此,如果可以特异性地检测出MELK的表达水平,则可将其用作相关疾病的诊断标记物。在本发明的相关内容中,MELK相关疾病或该疾病的发病因素的诊断标记物是从受试对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质,该MELK蛋白质通过与本发明的抗体或其抗原结合片段之间的结合而被检测出来,当该MELK蛋白质的表达水平与对照水平相比较高时,表示该受试对象患有上述疾病或具有发病风险。此处,上述对照水平是正常对照水平,优选为从未患有MELK相关疾病的健康受试对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质的表达水平。通常,对照水平优选为与下述组织相同的组织中的表达水平,该组织为待检测诊断标记物的癌细胞的来源的组织。

本发明还提供本发明的抗体或其抗原结合片段,其用于诊断MELK相关疾病或该疾病的发病因素。或者,本发明中,提供本发明的抗体或其抗原结合片段的用途,其用于制备对MELK相关疾病或该疾病的发病因素进行诊断的试剂。

此外,本发明提供了检测出MELK抑制剂治疗应答性标记物的方法,其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测出样品中的MELK蛋白质作为上述应答性标记物的阶段。已知:MELK在某些癌细胞中的表达得到特异性增强,并且这些癌细胞的增殖因MELK抑制剂而被抑制(WO2004/031413、WO2006/016525、WO2007/013665、WO2008/023841)。即,可以使用MELK的表达作为指标来预测对MELK抑制剂的响应性。如果MELK以高水平表达,则可以能够期待MELK抑制剂对细胞增殖的抑制作用。因此,如果可以特异性检测出MELK的表达水平,则可将其用作MELK抑制剂治疗应答性标记物。在本发明的相关内容中,MELK抑制剂治疗应答性标记物是从受试对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质,其通过与本发明的抗体或其抗原结合片段之间的结合而被检测出来,当该MELK蛋白质的表达水平与对照水平相比相同或更高时,表示MELK抑制剂在上述受试对象中的治疗效果较高。此处,上述对照水平优选为疾病对照水平,即从被认为患有MELK相关疾病的受试对象的疾病部位中分离得到的样品中MELK蛋白质的表达水平,特别优选为在治疗前从通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象中分离得到的样品中MELK蛋白质的表达水平。

此外,本发明还提供本发明的抗体或其抗原结合片段,其用于对通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象进行筛选。或者,本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段的用途,其用于制备对通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象进行筛选的试剂。

本发明进一步提供检测出MELK抑制剂的药效标记物的方法,其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测出样品中的MELK蛋白质作为该药效标记的阶段。已知:MELK在某些癌细胞中的表达得到特异性增强,并且这些癌细胞的增殖因MELK抑制剂而被抑制(WO2004/031413、WO2006/016525、WO2007/013665、WO2008/023841)。因此,具有这种癌细胞的癌组织会因MELK抑制剂而减少或死亡。即,使用MELK的表达水平作为指标,可以对具有这种癌细胞的受试对象中的MELK抑制剂的药效进行评价。如果从具有MELK阳性癌细胞的组织中分离得到的样品中MELK的表达水平与通过MELK抑制剂进行治疗前分离得到的样品相比有所降低,则可认为MELK阳性癌细胞因MELK抑制剂而减少。因此,如果可以特异性检测出MELK的表达水平,则可将其用作MELK抑制剂的药效标记物。在本发明的相关内容中,MELK抑制剂的药效标记物是指,通过与本发明的抗体或其抗原结合片段之间的结合而被检测出来的、从给药了MELK抑制剂的受试对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质,当MELK蛋白质的表达水平低于对照水平时,表示MELK抑制剂在上述受试对象中具有药效。此处,对照水平优选为在给药前从上述受试对象的疾病部位中分离得到的样品中MELK蛋白质的表达水平。

本发明中,提供了本发明的抗体或其抗原结合片段,其用于对通过MELK抑制剂治疗后的药效进行判定。或者,本发明中,提供本发明的抗体或其抗原结合片段的用途,其用于制备对通过MELK抑制剂治疗后的药效进判定的试剂。

IV.用于诊断MELK相关疾病、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象、或判定通过MELK抑制剂治疗后的药效的试剂或试剂盒

本发明提供用于诊断MELK相关疾病、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象、或判定通过MELK抑制剂治疗后的药效的试剂或试剂盒。具体而言,这些试剂盒含有本发明的抗体或其抗原结合片段作为MELK蛋白质的检测试剂。在一个实施方式中,用于本发明的诊断试剂或试剂盒的抗体可以用荧光物质、发光物质、放射性同位素等进行标记。用于标记抗体的方法与用于检测出标记抗体的方法是本领域所公知的,并且本发明可以利用任意的标记与方法。

本试剂盒可以包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及其他标记物检测试剂的组合。本试剂盒可以进一步包含MELK的阳性与阴性的对照试剂、以及用于检测出本发明的抗体的二次抗体。例如,被认为高表达MELK的细胞株的培养切片或组织样品可用作有用的阳性对照试剂。此外,例如从健康受试对象或非癌性组织中获得的组织样品可以用作有用的阴性对照试剂。用于检测出本发明的抗体的二次抗体优选用荧光物质、发光物质、放射性同位素、酶进行标记。本发明的试剂盒可以进一步包含缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器、记载使用说明的添附书文(例如,书面、胶带、CD-ROM等),也可以包含从商业立场或用户的立场来看所期望的其他材料。这些试剂等可以保持在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶子、小瓶、试管等。容器可以由玻璃或塑料等各种材料形成。

在本说明书中已经详细说明了关于本发明的特定实施方式,但应该理解为,上述说明实际上是示例性且说明性的,旨在说明本发明与其优选的实施方式。通过常规的实验,本领域技术人员在不脱离本发明的精神与范围的情况下,可以容易地在其中进行各种变更与修正。因此,本发明不被上述说明所,旨在由添附的权利要求的范围及其等价物所规定。

以下,将参考实施例来更详细地说明本发明。然而,尽管以下材料、方法和实施例在本发明的实施方式的制备与使用中能够帮助本领域技术人员,但它们仅用于说明本发明的实施方案,绝对没有限定本发明的范围的意图。本领域技术人员可以使用与本说明书中记载的那些相类似或等同的方法和材料来实施或试验本发明。

需要说明的是,本说明书中引用的所有的现有技术文献均并入本说明书中作为参照。

实施例

下面将举出实施例来详细说明本发明,但这些实施例并不限定本发明。

[材料与方法]

细胞培养

将MELK表达载体导入购自GenHunter的人胎儿肾细胞株293T中,制得MELK强制表达细胞株(MELK/293T),并且制备导入空载体的细胞株(Mock/293T)作为阴性对照。在37℃、5%CO2的加湿气氛中,维持在补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM中。将购自ATCC的人乳腺癌细胞株即MCF-7维持在37℃、5%CO2加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素、非必需氨基酸、丙酮酸钠、胰岛素的MEM中。将购自JCRB的人肝癌细胞株即Hep G2维持在37℃、5%CO2的加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的DMEM中。将从东北大学老年医学研究所分发的人胰腺癌细胞株即PK-45P、购自大日本制药公司的人肺癌细胞株A549维持在37℃、5%CO2的加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的RPMI1640中。将购自ATCC的人乳腺癌细胞株即BT-549维持在37℃、5%CO2的加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素、HEPES、丙酮酸钠、胰岛素的RPMI1640中。将购自ATCC的人结肠癌细胞株即HT-29维持在37℃、5%CO2的加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的McCoy’s 5A中。将购自ATCC的人乳腺癌细胞株即MDA-MB-231维持在37℃、不含CO2的加湿气氛中的补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的L-15中。

临床样本

源自外科手术切除的乳腺癌中的组织样本(福尔马林固定石蜡切片、冷冻组织)及其相应的临床信息是在取得书面知情同意的前提下,从神奈川癌症中心获得的。

免疫组织化学染色(IHC)

将福尔马林固定石蜡切片化而得的MELK/293T、Mock/293T、MCF-7、Hep G2、HT-29、PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549、以及临床标本在二甲苯中每次浸渍3分钟浸渍3次并且脱蜡后,在100%乙醇中每次浸渍1分钟浸渍两次,在90%、70%、50%的乙醇中各浸渍1分钟并使其再水化。将为了抗原活化处理而浸渍在抗原活化液pH9(Nichirei Biosciences)中的切片在125℃下培养30秒钟。培养后,将其在室温下放置20分钟并用流水洗涤5分钟。将其浸渍在3.0%过氧化氢水中10分钟以阻断内因性过氧化物酶,通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)(TBS-T(Takara Bio))每次5分钟地洗涤3次。此外,为了阻断非特异性反应,将适量的蛋白质阻断(Protein Block)溶液(Dako)滴在目标切片上,静置10分钟。通过湿润箱,分别滴加适量的1次抗体(OTSMAb01、MELK(N449)pAb、MELK(HPA017214)pAb),静置60分钟后,通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)每次5分钟洗涤3次。通过湿润箱,滴加适量的Histofine Simple Stain MAX-PO(Nichirei Biosciences)作为2次抗体,静置30分钟。通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)每次5分钟洗涤3次。通过DAB基质溶液(Nichirei Biosciences)进行显色反应。将滑动切片浸渍在苏木精(Dako)中20秒钟,用流水洗涤。分别在50%、70%、90%乙醇中浸渍1分钟,在100%乙醇中每次1分钟浸渍2次,进行脱水。最后,将切片在二甲苯中每次3分钟浸渍两次,使其透彻,并通过Mount-Quick(DAIDO SANGYO)进行封入。

RT-PCR

就临床冷冻组织(乳腺癌)而言,将冷冻组织片浸入TRIzol Reagent(Invitrogen)中、磨碎、并进行氯仿提取。向得到的提取液中添加大致等量的70%乙醇,使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)提取总RNA。使用SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)的逆转录酶,由总RNA合成cDNA。使用ExTaq(Takara Bio)并且以cDNA为模板进行PCR反应。表达分析目标基因是MELK,持家基因(housekeeping gene)是β-肌动蛋白。就MELK而言,使用MELK-1F:5’-ATGATCACCTCACGGCTA -3’(SEQ ID NO:12)、MELK-1R:5’-AGGTGTTCTGCATAAGG-3’(SEQ ID NO:13)的引物组进行扩增,就β-肌动蛋白而言,使用Beta-actin Fw:5’-AGGATGCAGAAGGAGATCAC-3’(SEQ ID NO:14)、Beta-actin Re:5’-AGAAAGGGTGTAACGCAACT-3’(SEQ ID NO:15)的引物组进行扩增。通过琼脂糖凝胶,将PCR扩增产物进行电泳,比较MELK基因的表达量。

蛋白质印迹

通过RIPA裂解缓冲液(Lysis Buffer),从MCF-7、Hep G2、HT-29、PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549中提取蛋白质。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目标蛋白质。将分离得到的目标蛋白质转移到硝酸纤维素(NC)上。在通过阻断溶液Block-Ace(DSPBIO公司)阻断与膜表面的非特异性结合后,将其与能够与目标蛋白质结合的试验抗体一起培养。通过TBST洗涤缓冲液,洗涤膜上多余的试验抗体,然后将其与能够与试验抗体结合的过氧化物酶(HRP)标记了的二次抗体一起培养,并通过洗涤缓冲液对膜上多余的二次抗体进行洗涤。通过ECL Western Blotting Detection System(GE Healthcare),使用产生可检测出的化学发光的膜并进行记录。

[实施例1]抗MELK单克隆抗体的制备

(1)产生抗MELK抗体的杂交瘤的取得

对人MELK蛋白质(SEQ ID NO:22)的免疫区域进行分析时,总抗原评分(total antigenic score)在形成长环结构的264-601氨基酸区域(SEQ ID NO:9)中良好地发生移位,并且序列特异性也良好,因此可以预测其抗原性较高(医学生物学研究所株式会社)。因此,为了产生MELK特异性抗体,将人MELK基因(SEQ ID NO:21)编码的人MELK蛋白质(SEQ ID NO:22)的264-601氨基酸区域(SEQ ID NO:9)的重组蛋白质作为免疫原。向Freund Adjuvant中加入50μg抗原肽后,使其乳化,并通过对Balb/c小鼠(日本SLC株式会社)进行皮下注射以进行初次免疫。通过皮下注射以相同方式制得的等量的25μg抗原肽,以实施第二次以后的免疫。从最后一次免疫起3天后,从小鼠中无菌制备脾细胞,并按照常规方法,通过聚乙二醇法进行与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的细胞融合。

(2)产生抗MELK抗体的杂交瘤的选择

通过使用了表达全长MELK蛋白质的293T细胞株(SEQ ID NO:22)的免疫组织化学染色,进行抗MELK抗体的选择。即,在将强制表达全长MELK蛋白质的293T细胞株进行福尔马林固定石蜡切片化后,实施免疫染色,选择MELK强制表达细胞株(MELK/293T)中观察到强反应的杂交瘤。

在经过试验的杂交瘤中,将已确认了以高水平产生MELK特异性抗体的杂交瘤克隆OTSMAb01的免疫组织化学染色结果示于图1中。如图1的照片和图表所示,当用OTSMAb01进行染色时,与市售的抗MELK多克隆抗体即MELK(N449)pAb和MELK(HPA017214)pAb一样,在由MELK强制表达细胞株(MELK/293T)制得的石蜡切片中观察到染色,即表示为MELK阳性细胞的比例较高。另一方面,在作为阴性对照的由导入有空载体的细胞株(Mock/293T)制得的石蜡切片中,几乎没有观察到染色,显示为MELK阳性细胞的比例较低。根据这些结果,表示为杂交瘤克隆OTSMAb01可用作产生在免疫组织化学染色中特异性检测出MELK的抗体的杂交瘤。

选择上述杂交瘤克隆OTSMAb01以产生用于接下来的实验的抗体。大量培养杂交瘤克隆OTSMAb01,2~3周后采集培养液。使用蛋白A柱(GE Healthcare,NJ)从培养物中纯化抗体。在本说明书中,本发明的抗体也称为克隆OTSMAb01。

[实施例2]抗MELK单克隆抗体的特异性的评价

接下来,使用MELK表达量不同的各种细胞株来评价OTSMAb01的特异性。即,将使用了OTSMAb01的免疫组织化学染色与蛋白质印迹的结果进行比较,并且讨论是否可以观察到与MELK蛋白质的表达量相对应的染色。

首先,通过使用了OTSMAb01的蛋白质印迹,确认了内因性MELK蛋白质在源自各种人癌组织的细胞株中的表达水平。如图2所示,源自人胰腺癌的细胞株PK-45P、源自人乳腺癌的细胞株BT-549和MDA-MB-231、以及源自人肺癌的细胞株A549是MELK高表达细胞株,源自人乳腺癌的细胞株MCF-7、源自人肝癌的细胞株Hep G2和源自人结肠癌的细胞株HT-29是MELK低表达细胞株。

随后,对于由上述细胞株制得的石蜡切片,使用OTSMAb01和市售的抗MELK多克隆抗体进行免疫组织化学染色。如图3所示,当用OTSMAb01进行染色时,在由确认了MELK进行了高表达的细胞株PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549制得的石蜡切片中,观察到染色。在这些石蜡切片中,在高比例的细胞中检测到阳性信号。另一方面,在由MELK的表达量较少的细胞株MCF-7、Hep G2、HT-29制得的石蜡切片中,几乎不染色,并且几乎检测不到阳性信号。

另一方面,当用市售的抗MELK抗体MELK(N449)pAb(Bioworld Technology)或MELK(HPA 017214)pAb(Sigma-Aldrich)进行染色时,无论内因性MELK蛋白质的表达量的多少,在所有试验的细胞株中,在大部分细胞中检测到信号。因此,怀疑通过这些市售抗体的检测结果中可能含有假阳性信号。

以上结果表示,本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)是用于获得与免疫组织化学染色中样品中的MELK蛋白质表达量相关的检测结果的有用的工具,与市售的抗MELK抗体相比,本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)具有以高特异性与MELK结合这样的有利特性。

[实施例3]临床样品中MELK蛋白质的检测

使用乳腺癌临床样品来评价本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)在免疫组织化学染色中的特异性。通过免疫组织化学染色和半定量RT-PCR,分别在乳腺癌临床样品1~3的肿瘤区域和非肿瘤区域中对MELK蛋白质与RNA的表达进行检测,其结果示于图4中。如图4所示,在确认了MELK的RNA的表达的肿瘤区域中,检测出由OTSMAb01染色的细胞,即检测出MELK阳性细胞,但在未确认到MELK的RNA的表达的非肿瘤区域中,几乎没有染色,未检测到MELK阳性细胞。该结果表明,OTSMAb01在临床样品中也可以特异性检测出MELK蛋白质。

[实施例4]抗MELK单克隆抗体的可变区的氨基酸序列的分析

分析了本发明的抗MELK抗体(OTSMAb01)的可变区的氨基酸序列。

使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN),从杂交瘤OTSMAb01中提取了总RNA。使用Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen),由总RNA合成了cDNA。用于cDNA合成的引物如下所述。

重链3’引物的mIGCUniRv:

5’-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3’(SEQ ID NO:16)

轻链3’引物的mIGKRv2:

5’-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3’(SEQ ID NO:17)

使用5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)将dC聚合物添加到cDNA末端,并使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)来扩增编码单克隆抗体的可变区的多核苷酸。用于扩增的引物如下所述。引物序列中的碱基“I”表示肌苷。

重链5’与轻链5’引物的5’RACE精简的锚定引物(Abridged Anchor Primer):

5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’(SEQ ID NO:18),

重链3’引物的mIGCUniRv2:

5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’(SEQ ID NO:19),以及

轻链3’引物的mIGKNesRv2:

5’-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3’(SEQ ID NO:20)。

将PCR产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega)中。确定插入片段区域的序列,并确定OTSMAb01的可变区(除信号序列外)的核酸序列。

以下述方式确定小鼠单克隆抗体的重链可变区与轻链可变区的氨基酸与核酸序列。

OTSMAb01,重链可变区氨基酸序列(除信号序列外):

EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSHHYSAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)(由SEQ ID NO:10中所示的核酸序列编码)

OTSMA b01,重链可变区核酸序列:

5’-GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTGTAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTAGTCACCATTACTCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3’(SEQ ID NO:10)

OTSMAb01,轻链可变区氨基酸序列(除信号序列外):

DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLIISRVEAEDLGVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)(由SEQ ID NO:11中所示的核酸序列编码)

OTSMA b01,轻链可变区核酸序列:

5’-GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTAGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCATAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACATATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3’(SEQ ID NO:11)

由Kabat的定义确定的本发明抗体(OTSMAb01)的CDR序列如下所述。

重链CDR1(CDR-H1):DYYMH(SEQ ID NO:1);

重链CDR2(CDR-H2):WIDPENGNTIYDPKFQG(SEQ ID NO:2);

重链CDR3(CDR-H3):HHYSAMDY(SEQ ID NO:3);

轻链CDR1(CDR-L1):RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:4);

轻链CDR2(CDR-L2):KVSNRFS(SEQ ID NO:5);以及

轻链CDR3(CDR-L3):SQSTYVPLT(SEQ ID NO:6)

工业实用性

本发明成功地制备了能够以高特异性对从临床样品等的对象中分离得到的样品中的MELK蛋白质进行检测的抗MELK抗体。通过使用本发明的抗MELK抗体,可以以高灵敏度和低背景检测出样品中的MELK蛋白质。因此,本发明的抗体可用于对表达MELK的癌症等MELK相关疾病进行诊断。此外,由于本发明的抗体可进行与样品中MELK的表达量相对应的MELK检测,因此,其可用于筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象(治疗前诊断)或受试对象中通过MELK抑制剂治疗后的药效判定(治疗后诊断)。

序列表

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<120> 针对MELK的单克隆抗体及其使用

<130> ONC-A1606P

<150> JP 2016-169085

<151> 2016-08-31

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR1

<400> 1

Asp Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2

<400> 2

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3

<400> 3

His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR

<400> 6

Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H链可变区域

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ser Val Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L链可变区域

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Ala Asp

115

<210> 9

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MELK 免疫原片段

<400> 9

Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe

1 5 10 15

Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr Glu Leu Ser Val His His Arg

20 25 30

Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp

35 40 45

His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly

50 55 60

Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser

65 70 75 80

Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp

85 90 95

Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp

100 105 110

Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser

115 120 125

Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser

130 135 140

Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys

145 150 155 160

Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe

165 170 175

Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg

180 185 190

Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg

195 200 205

Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr

210 215 220

Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys

225 230 235 240

Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro

245 250 255

Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp

260 265 270

Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg

275 280 285

Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg

290 295 300

Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro

305 310 315 320

Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln

325 330 335

Thr Gln

<210> 10

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H链可变区的核苷酸序列

<400> 10

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg 60

tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa tactatatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccagtgta acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tagtcaccat 300

tactctgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 11

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L链可变区的核苷酸序列

<400> 11

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttagaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcataatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac atatgttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgat 345

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MELK的人工合成的正向引物序列

<400> 12

atgatcacct cacggcta 18

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MELK的人工合成的反向引物序列

<400> 13

aggtgttctg cataagg 17

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白的人工合成的正向引物序列

<400> 14

aggatgcaga aggagatcac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白的人工合成的反向引物序列

<400> 15

agaaagggtg taacgcaact 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH的人工合成的3'引物序列

<400> 16

ctgggaaggt gtgcacac 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的人工合成的3'引物序列

<400> 17

gttgttcaag aagcacacga c 21

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH及VL的人工合成的5'引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n是肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> n 是肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> n 是肌苷

<400> 18

ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH的人工合成的3'引物序列

<400> 19

tggacaggga tccagagttc c 21

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的人工合成的3'引物序列

<400> 20

cagatgttaa ctgctcactg gatgg 25

<210> 21

<211> 2486

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> CDS

<222> (185)..(2140)

<300>

<308> Genbank acc no. NM_014791.3

<309> 2015-09-25

<313> (1)..(2486)

<400> 21

gagatttgat tcccttggcg ggcggaagcg gccacaaccc ggcgatcgaa aagattctta 60

ggaacgccgt accagccgcg tctctcagga cagcaggccc ctgtccttct gtcgggcgcc 120

gctcagccgt gccctccgcc cctcaggttc tttttctaat tccaaataaa cttgcaagag 180

gact atg aaa gat tat gat gaa ctt ctc aaa tat tat gaa tta cat gaa 229

Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu

1 5 10 15

act att ggg aca ggt ggc ttt gca aag gtc aaa ctt gcc tgc cat atc 277

Thr Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile

20 25 30

ctt act gga gag atg gta gct ata aaa atc atg gat aaa aac aca cta 325

Leu Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu

35 40 45

ggg agt gat ttg ccc cgg atc aaa acg gag att gag gcc ttg aag aac 373

Gly Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn

50 55 60

ctg aga cat cag cat ata tgt caa ctc tac cat gtg cta gag aca gcc 421

Leu Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala

65 70 75

aac aaa ata ttc atg gtt ctt gag tac tgc cct gga gga gag ctg ttt 469

Asn Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe

80 85 90 95

gac tat ata att tcc cag gat cgc ctg tca gaa gag gag acc cgg gtt 517

Asp Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val

100 105 110

gtc ttc cgt cag ata gta tct gct gtt gct tat gtg cac agc cag ggc 565

Val Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly

115 120 125

tat gct cac agg gac ctc aag cca gaa aat ttg ctg ttt gat gaa tat 613

Tyr Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr

130 135 140

cat aaa tta aag ctg att gac ttt ggt ctc tgt gca aaa ccc aag ggt 661

His Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly

145 150 155

aac aag gat tac cat cta cag aca tgc tgt ggg agt ctg gct tat gca 709

Asn Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala

160 165 170 175

gca cct gag tta ata caa ggc aaa tca tat ctt gga tca gag gca gat 757

Ala Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp

180 185 190

gtt tgg agc atg ggc ata ctg tta tat gtt ctt atg tgt gga ttt cta 805

Val Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu

195 200 205

cca ttt gat gat gat aat gta atg gct tta tac aag aag att atg aga 853

Pro Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg

210 215 220

gga aaa tat gat gtt ccc aag tgg ctc tct ccc agt agc att ctg ctt 901

Gly Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu

225 230 235

ctt caa caa atg ctg cag gtg gac cca aag aaa cgg att tct atg aaa 949

Leu Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys

240 245 250 255

aat cta ttg aac cat ccc tgg atc atg caa gat tac aac tat cct gtt 997

Asn Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val

260 265 270

gag tgg caa agc aag aat cct ttt att cac ctc gat gat gat tgc gta 1045

Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val

275 280 285

aca gaa ctt tct gta cat cac aga aac aac agg caa aca atg gag gat 1093

Thr Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp

290 295 300

tta att tca ctg tgg cag tat gat cac ctc acg gct acc tat ctt ctg 1141

Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu

305 310 315

ctt cta gcc aag aag gct cgg gga aaa cca gtt cgt tta agg ctt tct 1189

Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser

320 325 330 335

tct ttc tcc tgt gga caa gcc agt gct acc cca ttc aca gac atc aag 1237

Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys

340 345 350

tca aat aat tgg agt ctg gaa gat gtg acc gca agt gat aaa aat tat 1285

Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr

355 360 365

gtg gcg gga tta ata gac tat gat tgg tgt gaa gat gat tta tca aca 1333

Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr

370 375 380

ggt gct gct act ccc cga aca tca cag ttt acc aag tac tgg aca gaa 1381

Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu

385 390 395

tca aat ggg gtg gaa tct aaa tca tta act cca gcc tta tgc aga aca 1429

Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr

400 405 410 415

cct gca aat aaa tta aag aac aaa gaa aat gta tat act cct aag tct 1477

Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser

420 425 430

gct gta aag aat gaa gag tac ttt atg ttt cct gag cca aag act cca 1525

Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro

435 440 445

gtt aat aag aac cag cat aag aga gaa ata ctc act acg cca aat cgt 1573

Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg

450 455 460

tac act aca ccc tca aaa gct aga aac cag tgc ctg aaa gaa act cca 1621

Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro

465 470 475

att aaa ata cca gta aat tca aca gga aca gac aag tta atg aca ggt 1669

Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly

480 485 490 495

gtc att agc cct gag agg cgg tgc cgc tca gtg gaa ttg gat ctc aac 1717

Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn

500 505 510

caa gca cat atg gag gag act cca aaa aga aag gga gcc aaa gtg ttt 1765

Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe

515 520 525

ggg agc ctt gaa agg ggg ttg gat aag gtt atc act gtg ctc acc agg 1813

Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg

530 535 540

agc aaa agg aag ggt tct gcc aga gac ggg ccc aga aga cta aag ctt 1861

Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu

545 550 555

cac tat aac gtg act aca act aga tta gtg aat cca gat caa ctg ttg 1909

His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu

560 565 570 575

aat gaa ata atg tct att ctt cca aag aag cat gtt gac ttt gta caa 1957

Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln

580 585 590

aag ggt tat aca ctg aag tgt caa aca cag tca gat ttt ggg aaa gtg 2005

Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val

595 600 605

aca atg caa ttt gaa tta gaa gtg tgc cag ctt caa aaa ccc gat gtg 2053

Thr Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val

610 615 620

gtg ggt atc agg agg cag cgg ctt aag ggc gat gcc tgg gtt tac aaa 2101

Val Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys

625 630 635

aga tta gtg gaa gac atc cta tct agc tgc aag gta taa ttgatggatt 2150

Arg Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val

640 645 650

cttccatcct gccggatgag tgtgggtgtg atacagccta cataaagact gttatgatcg 2210

ctttgatttt aaagttcatt ggaactacca acttgtttct aaagagctat cttaagacca 2270

atatctcttt gtttttaaac aaaagatatt attttgtgta tgaatctaaa tcaagcccat 2330

ctgtcattat gttactgtct tttttaatca tgtggttttg tatattaata attgttgact 2390

ttcttagatt cacttccata tgtgaatgta agctcttaac tatgtctctt tgtaatgtgt 2450

aatttctttc tgaaataaaa ccatttgtga atatag 2486

<210> 22

<211> 651

<212> PRT

<213> 人类

<400> 22

Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu Thr

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile Leu

20 25 30

Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu Gly

35 40 45

Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn Leu

50 55 60

Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala Asn

65 70 75 80

Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe Asp

85 90 95

Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val Val

100 105 110

Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly Tyr

115 120 125

Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr His

130 135 140

Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly Asn

145 150 155 160

Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala Ala

165 170 175

Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp Val

180 185 190

Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu Pro

195 200 205

Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg Gly

210 215 220

Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu Leu

225 230 235 240

Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys Asn

245 250 255

Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu

260 265 270

Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr

275 280 285

Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu

290 295 300

Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu

305 310 315 320

Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser

325 330 335

Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser

340 345 350

Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val

355 360 365

Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly

370 375 380

Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro

405 410 415

Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala

420 425 430

Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val

435 440 445

Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr

450 455 460

Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile

465 470 475 480

Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val

485 490 495

Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln

500 505 510

Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly

515 520 525

Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser

530 535 540

Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His

545 550 555 560

Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn

565 570 575

Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys

580 585 590

Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val Thr

595 600 605

Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val Val

610 615 620

Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys Arg

625 630 635 640

Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val

645 650

再多了解一些
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