鼠肉与山羊肉、绵羊肉多重PCR检测试剂盒及鉴定方法与流程

文档序号:18145666发布日期:2019-07-10 11:47
鼠肉与山羊肉、绵羊肉多重PCR检测试剂盒及鉴定方法与流程

本发明涉及分子生物学技术在肉制品检测领域的应用,更具体地说,是一种鼠肉(大白鼠、小白鼠、豚鼠、褐家鼠)、山羊肉与绵羊肉DNA快速鉴定试剂盒及检测方法。



背景技术:

肉类食品属民生食用产品,其质量的好坏关系人民群众健康和生命安全。日常生活中,我们食用的羊肉多为绵羊肉和山羊肉。山羊肉为牛科动物青羊的肉。补虚助阳。治虚劳内伤,筋骨痹弱,腰脊酸软,阳痿,带下,不孕。山羊肉中有一种传统的优质羊肉叫柏籽羊肉,素以鲜嫩清香、无腥膻味而闻名,被誉为“土人参”“补心丸”。上世纪80年代以来,张勇飞等专家根据《黄帝内经˙素问˙萎论》“脾主身之肌肉”原理和现代生物分子学理论,以中药为手段,可使普通山羊肉转化为柏籽羊肉,作为药膳食用。绵羊肉肌肉呈暗红色,肉纤维细而软,肌肉间夹有白色脂肪,脂肪较硬且脆。山羊肉肉色较绵羊肉淡,有皮下脂肪,只在腹部有较多的脂肪,肉有膻味。绵羊肉的脂肪含量会更高一些,山羊肉它最重要的特点就是胆固醇含量是比较低的,所以说对于心脑血管疾病以及心脏病等等能够起着一定的预防功效,所以在日常生活当中患有高血脂,高血压以及老人们最好吃山羊肉。

目前肉制品市场上鼠肉冒充羊肉事件频发。因生鼠肉是粉色的,和羊肉的色泽、纹路接近,不法商贩为节约成本购入未经检验检疫的老鼠肉,添加明胶、胭脂红等冒充羊肉,以肉卷、肉串、肉丸、火腿肠等形式销售至各地农贸市场。大约75%的人类感染可能来自不同途径直接或间接接触的动物产品,鼠属于啮齿类的哺乳动物,繁殖速度快,数量多,对居住的环境和食物要求不高,是多种传染病病原的储存宿主和主要传染源,鼠体内的部分病毒即便通过高温加热也很难被消除或减弱。目前,据报道用于肉类产品掺假的鼠类主要来源于医学实验室的小白鼠、大白鼠和豚鼠;野外捕获的田鼠、褐家鼠等。实验室鼠虽经检疫,但在实验室制作动物模型或临床用药前评估时,喂养鼠饲料添加一些特定药品或直接在鼠体内注射药品,这些药品在肉里大量存在,人食用后会导致机体损害!部分野外老鼠是食用鼠药毒死的,食用者存在中毒的风险,因此鼠肉是绝不允许被摆上餐桌的。掺假肉制品的出现会影响消费者的身体健康和生命安全。此外,这些掺假肉制品出口到国外会严重损害食品企业形象及国家信誉。基于食品安全性与质量监督的需要,有必要对食品中动物源性成分进行检测。

国内外常用的检测掺假肉的方法有感官鉴定技术、光谱色谱分析、酶联免疫吸附技术、常规PCR,实时荧光定量PCR和数字PCR等。感官鉴定技术需要检验人员对各物种的细微形态有较强的认识;近红外光谱主要对肉类中的含氢基团进行检测,其缺点是需大量样品建立与分析模型,且检测精度不高;色谱分析仅适用于新鲜和冷冻肉类;在肉类加工过程中,蛋白质易变性而使酶联免疫反应失效,所以酶联免疫吸附技术只适合于未加工过的肉制品;电子鼻和电子舌在硬件结构和识别算法上仍存在仿生性差的缺点;目前对于动物源成分检测的国家标准和行业标准主要采用PCR法。实时荧光定量PCR和数字PCR能够同时进行特异性识别和量化,提供更精确和可靠的定量数据。但应用的仪器、试剂价格昂贵,且耗时长,对检测技术人员要求高,操作难度大,不适宜快速批量检测使用。

线粒体DNA基因组在动物物种鉴定方面比核基因以及核糖体12S和16S基因更具优势,线粒体DNA作为唯一的核外遗传信息载体,具有独立复制、进化速度快、不受核基因影响等特点,被广泛用于动物的种属鉴别研究中。在线粒体13个编码蛋白的基因中,Cyt b基因拥有合适的进化速率和长度,在Gene Bank数据库中拥有最多的基因数据,在动物属间、种间存在多样性,被广泛用于物种间的鉴别工作。因此,本研究选择各物种Cyt b基因设计特异性引物,建立多重PCR反应体系,完成对鼠、山羊、绵羊三个物种的特异性鉴别。

利用多重PCR技术,在同一个PCR反应管中加入多对特异性引物,同时对多个目的基因进行扩增分析,节省检测时间和检测成本,为临床或食品安全检测提供更多更准确的信息,具有高效性、系统性、经济简便性等优点。



技术实现要素:

本发明的目的是在建立鼠肉(大白鼠、小白鼠、豚鼠、褐家鼠)、山羊肉与绵羊肉线粒体 DNA的基因组文库基础上,采用生物信息学技术对鼠肉、山羊肉与绵羊肉线粒体DNA基因组进行筛选,设计可有效地区分鼠肉、山羊肉与绵羊肉的特异性DNA序列,利用多重PCR 技术在一个反应体系中加入三对特异性引物,针对三个模板可扩增三个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别鼠肉、山羊肉与绵羊肉特异性分子标志,使用方便的鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR检测试剂盒,具有节省时间、降低成本和提高效率的特点,并提供简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的:

鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR检测试剂盒,它包含:

1.线粒体DNA提取体系

P1溶液30mL,P2溶液30mL,P3溶液10mL,P4溶液30mL,P5溶液30mL,P6溶液 50mL;

2.鼠、山羊及绵羊三对线粒体DNA特异寡核苷酸引物

在GenBank中下载种属基因序列,再应用NCBI Primer-BLAST在线引物设计软件设计,具体引物序列如下:

引物1(鼠,扩增长度102bp)

Forward primer:5′TGAGGTGCTACCGTTATT3′

Reverse primer:5′GGTGGCTTTGTCTACTGA3′

引物2(山羊,扩增长度219bp)

Forward primer:5′TACTCGGAGACCCAGACAAC3′

Reverse primer:5′GGCTGATTGGGCGGAATATT3′

引物3(绵羊,扩增长度364bp)

Forward primer:5′TTCACCTACTCTTCCTCCAC3′

Reverse primer:5′ATTATGCTCCGTTGCTTT3′

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

3.鼠肉、山羊肉、绵羊肉阳性对照品

紫外灯下切下鼠肉、山羊肉、绵羊肉特异性DNA片段,进行凝胶回收;测定其浓度,转化大肠杆菌后涂板过夜培养;蓝白筛选后转入LB液体培养基于37℃恒温气浴振荡器中培养过夜;质粒小提,测定其DNA浓度。选取浓度超过100ng/μL的样本交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。分析测序结果,并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。

4.多重PCR反应体系

鉴定反应体系(3管)800μL;阳性对照反应体系(3管),鼠肉(C-鼠阳)、山羊肉(C- 山羊阳)、绵羊肉(C-绵羊阳)各1管,各50μL;阴性对照反应体系1管,50μL。

(a)鉴定反应体系:总体系为50μL,其中含有反应缓冲液(10×)5μL,dNTP(2.5mmol·L-1) 2-5μL,MgCl2(2.5mmol·L-1)3μL,Taq DNA聚合酶1-5μL,引物1、引物2和引物3(10μmol·L-1) 中的每种0.5-2μL,待检样本DNA1-3μL,余为双蒸馏水;

(b)阳性对照反应体系:总体系为50μL,其中含有反应缓冲液(10×)5μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)2-5μL,MgCl2(2.5mmol·L-1)3μL,Taq DNA聚合酶1-5μL,引物1、引物2和引物3(10μmol·L-1)中的每种0.5-2μL,鼠肉、山羊肉及绵羊肉DNA(1:1:1)混合物1-3μL,余为双蒸馏水;

(c)阴性对照液:貂肉或狐狸肉DNA按1:1混合1-3μL。

5.多重PCR反应条件

分别将鼠肉、山羊肉及绵羊肉基因组DNA加入PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、 (b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各50μL加入反应管中,置于PCR 反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5min,94℃30s,退火50-55℃30s,72℃45s,30个循环,72℃延伸7min,4℃;

6.结果判定

反应产物使用1.5%琼脂糖凝胶,在DYY-Ⅲ型水平电泳仪上电泳,85mV电泳1h,分子量100bp的DNA Marker作参照,凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。凝胶电泳图谱中,鼠、山羊、绵羊在100-400bp处,在与阳性对照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、绵羊(364bp) 凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带,空白对照无条带,判定为含有相应肉类成分。

鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR检测试剂盒快速鉴定方法,它包含以下步骤:

1.样本前处理

取待检样本50mg置于无菌烧杯中,加入10mL生理盐水溶液浸泡20min,在平皿中用手术刀去除结缔组织后将组织切碎。

2.线粒体DNA提取

(1)裂解向经过前处理的样品中加入37℃预热的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混匀,56℃水浴振荡1小时。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,离心(转速为每分钟10000转)10分钟。吸取上清液 500μL和P5溶液500μL置于离心管中,-20℃放置1h,离心(转速为每分钟10000转)10 分钟,弃去上清液。

(3)洗涤用P6溶液500μL洗涤沉淀物1次,离心(转速为每分钟11000转)10分钟,弃去上清液(重复1次),沉淀室温干燥,加入80μL TE溶解DNA,作为供试品溶液。

3.建立PCR反应

(1)阳性对照取3支无菌空白溶液管,分别加入预混好的鼠、山羊、绵羊阳性对照反应液50μL;

(2)阴性对照取1支无菌空白溶液管,加入预混好的鉴定反应液47-49μL,同时加入阴性对照液1-3μL,混匀,做好标记。

(3)PCR反应在无菌空白溶液管中加入预混好的鉴定反应液47-49μL,同时加入相应的供试品DNA溶液1-3μL,混匀,做好标记。

(4)反应程序反应管置于PCR反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5min,94℃ 30s,退火50-55℃30s,72℃45s,30个循环,72℃延伸7min,4℃。

4.结果判定

反应产物使用1.5-1.8%琼脂糖凝胶,在DYY-Ⅲ型水平电泳仪上电泳,70-85mV电泳 45min-1h,分子量100bp的DNA Marker作参照,凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。凝胶电泳图谱中,鼠、山羊、绵羊在100-400bp处,在与阳性对照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、绵羊(364bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现3条DNA条带,空白对照无条带,判定为含有相应肉类成分。参照图1。

本发明的鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR检测试剂盒是利用鼠肉、山羊肉及绵羊肉细胞色素b具有的种属特异性,能够准确同时区别鼠肉、山羊肉及绵羊肉的特异性;鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。

附图说明

图1为试剂盒检测鼠肉、山羊肉及绵羊肉鉴定结果示意图。

其中:1:为阳性对照品(鼠肉+山羊肉+绵羊肉);M:为标准分子量(100bp ladder marker); 2:为褐家鼠肉结果;3:为褐家鼠肉+牛肉结果;4:为小白鼠肉+猪肉结果;5:为山羊肉结果;6:为绵羊肉结果;7:为绵羊肉+豚鼠肉结果;8:为空白对照结果。

图2实施例一检测鲜鼠肉、鲜山羊肉及鲜绵羊肉鉴定结果示意图。

其中:1:阳性对照品(鼠肉+山羊肉+绵羊肉);M:为标准分子量(100bp laddermarker); 2:褐家鼠肉+山羊肉;3:褐家鼠肉+绵羊肉;4:山羊肉+绵羊肉;5:小白鼠肉;6:山羊肉;7:绵羊肉;8:豚鼠肉+山羊肉+绵羊肉;9:空白对照。

图3实施例二检测烘培后的鼠肉、山羊肉及绵羊肉制品鉴定结果示意图。

其中:1:为阳性对照品(鼠肉+山羊肉+绵羊肉);M:为标准分子量(100bp laddermarker); 2:为烘培后褐家鼠肉;3:为烘培后褐家鼠肉+市售牛肉火腿肠;4:为烘培后小白鼠肉+市售鸡肉串;5:市售绵羊肉卷;6:市售山羊肉;7:为市售羊肉串;8:空白对照。

具体实施方式:

下面利用实施例一对本发明作进一步描述。

材料为鼠肉、山羊肉、绵羊肉、狗肉、貂肉、狐狸肉(样本均由长春市食品药品检验中心提供)。

1.样本前处理

取待检样本50mg置于无菌烧杯中,加入10mL生理盐水溶液浸泡20min,在平皿中用手术刀去除结缔组织后将组织切碎。

2.线粒体DNA提取

(1)裂解向经过前处理的样品中加入37℃预热的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混匀,56℃水浴振荡1h。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,离心(转速为10000r/min)10min。吸取上清液500μL 和P5溶液500μL置于离心管中,-20℃放置1h,离心(转速为每分钟10000转)10分钟,弃去上清液。

(3)洗涤用P6溶液500μL洗涤沉淀物1次,离心(转速为10000r/min)10min,弃去上清液(重复1次),沉淀室温干燥,加入80μL TE溶解DNA,作为供试品溶液。

3.建立PCR反应

(1)阳性对照取3支无菌空白溶液管,分别加入预混好的鼠、山羊、绵羊阳性对照反应液50μL;

(2)阴性对照取1支无菌空白溶液管,加入预混好的鉴定反应液47μL,同时加入阴性对照液3μL,混匀,做好标记。

(3)PCR反应在无菌空白溶液管中加入预混好的鉴定反应液4μL,同时加入相应的供试品DNA溶液3μL,混匀,做好标记。

(4)反应程序反应管置于PCR反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5min,94℃ 30s,退火53℃30s,72℃45s,30个循环,72℃延伸7min,4℃。

4.结果判定

反应产物使用1.5%琼脂糖凝胶,在DYY-Ⅲ型水平电泳仪上电泳,85mV电泳1h,分子量100bp的DNA Marker作参照,凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。凝胶电泳图谱中,鼠、山羊、绵羊在100-400bp处,在与阳性对照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、绵羊(364bp) 凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带,空白对照无条带,判定为含有相应肉类成分,参照图2。

实施例二对烘培后的鼠肉、市售山羊肉及绵羊肉制品进行鉴定

材料为烘培后鼠肉(鼠肉由长春市食品药品检验中心提供);市售牛肉火腿肠;市售鸡肉串;市售绵羊肉卷;市售山羊肉;市售羊肉串(市售样本均为吉林市大福源超市购买)。

1.样本前处理

取待检样本50mg置于无菌烧杯中,加入10mL生理盐水溶液浸泡20min,在平皿中用手术刀去除结缔组织后将组织切碎。

2.线粒体DNA提取

(1)裂解向经过前处理的样品中加入37℃预热的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混匀,56℃水浴振荡1h。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,离心(转速为10000r/min)10min。吸取上清液500μL 和P5溶液500μL置于离心管中,-20℃放置1h,离心(转速为10000r/min)10min,弃去上清液。

(3)洗涤用P6溶液500μL洗涤沉淀物1次,离心(转速为11000r/min)10min,弃去上清液(重复1次),沉淀室温干燥,加入80μL TE溶解DNA,作为供试品溶液。

3.建立PCR反应

(1)阳性对照取3支无菌空白溶液管,分别加入预混好的鼠、山羊、绵羊阳性对照反应液50μL;

(2)阴性对照取1支无菌空白溶液管,加入预混好的鉴定反应液47μL,同时加入阴性对照液3μL,混匀,做好标记。

(3)PCR反应在无菌空白溶液管中加入预混好的鉴定反应液4μL,同时加入相应的供试品DNA溶液3μL,混匀,做好标记。

(4)反应程序反应管置于PCR反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5min,94℃ 30s,退火53℃30s,72℃45s,30个循环,72℃延伸7min,4℃。

4.结果判定

反应产物使用1.5%琼脂糖凝胶,在DYY-Ⅲ型水平电泳仪上电泳,85mV电泳1h,分子量100bp的DNA Marker作参照,凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。凝胶电泳图谱中,鼠、山羊、绵羊在100-400bp处,在与阳性对照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、绵羊(364bp) 凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带,空白对照无条带,判定为含有相应肉类成分,参照图3。

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